重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明设及生物技术领域，尤其设及一种在富含高浓度葡萄糖和谷氨酷胺的无蛋 白质培养基中代谢适应生长的高产稳定表达细胞克隆的筛选方法，该方法用于灌流发酵过 程中生产治疗性抗体。
【背景技术】
[000引治疗性抗体是生物技术药物市场的主要类另iKWalsh G，2014,化化re Biotechnology 2014,32: 992-1000)。不同的治疗性抗体已经获得注册批准，用于治疗癌 症、自身免疫病和其他慢性疾病，一些重组抗体也正处于不同的临床发展阶段（Biologic Medicines in Development,化rma R巧ort 2013，www. P虹ma.o;rg)。迄今为止最畅销的抗 体均祀向炎症性疾病。可W预见的医疗需求将远远超过全球现有抗体的产能。
[0003] 用于规模化生产工艺的细胞系生产力是关键问题。基因扩增系统和细胞培养基优 化已经被评价用于增加抗体生产率。已经报道基因修饰和重组骨髓瘤细胞系的遗传适应用 于生产治疗性抗体（Barnes et al.，2000，切totechnology 32:109-123 巧arnes et al., 2007, Biotechnol Bioeng 96:337-349)。
[0004] 灌流发酵工艺允许在发酵收获液中高密度细胞培养来增加抗体浓度。但是，高密 度细胞培养会因代谢需求而降低抗体生产速率。经肿瘤细胞增强的有氧糖酵解与促进生物 分子合成和细胞持续生长的合成代谢有关系（Vander Heiden MG et al., 2009, Science 324: 1029-1033; Levine AJ et al.，2010，Science 330: 1340-1:344)。生产重组抗体 的NSO细胞克隆已经成功的适应在无蛋白质培养基中生长（W02004/038010 Al)。然而， 适应无血清培养基和进一步无血清培养基中的长期发酵工艺通常伴随着细胞系生产力的 损失（Barnes et al., 2003, Biotechnol Bioeng 81: 631-639 ;Barnes et al., 2004， Biotechnol Bioeng 85: 115-121)。而重组骨髓瘤细胞系的高密度细胞培养的代谢需求没 有得到妥善解决。
[0005] 适应在无蛋白质培养基中高产稳定表达的细胞克隆可W从工业化的不稳定重组 骨髓瘤细胞系中重新获得（CN104152415A)。但是在实践中，一些重组骨髓瘤细胞系从无血 清培养基到无蛋白质培养基的适应过程伴随着抗体生成率的降低。稳定但低表达细胞系不 适合工业灌流发酵工艺。增加抗体生产率而不导致抗体分泌不稳定是任何细胞系优化过程 中的一个关键步骤。
[0006] 生物药品通常是复杂的糖蛋白分子。单克隆抗体是由具有N-和0-糖基化位点的 4条多肤链组成。生产工艺中任何变化都可能导致抗体分子理化性质的变化。在生物制药 工业上可比较性概念出现用于评价产品属性上的变化（Demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products, Center for Biologies Evaluation and Research (CBER), Center for Drug Evaluation and Research (CDER) April 1996; EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances: Quality issues (CPMP December 2003)： ICH Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process. EU: Adopted by CMPM, December 1, 2004, CPMP/ICH/5721/03, date for coming into operation: June 2005; MHLW: Adopted 26 April 2005， PFSB/ELD Notification No. 0426001: FDA: Published in 化e Federal Register, Vol. 70， No. 125，化ne 30， 2005; 37861-2)。
[0007] 生产工艺上的变化当中，一个被认为关键的改变就是细胞系上的改变。然而在生 产工艺开发中，也经常通过优化细胞系来提高其生产力。细胞系优化后的每一步，必须进行 可比性研究来确保产品属性不变。每个单克隆抗体的分子表型是进行任何设及生产工艺修 改的可比性研究的先决条件，例如细胞系、生产规模和生产现场。
[000引 Itolizumab是一种识别淋己细胞上CD6分化抗原的人源化抗体（Roque-Navarro et al.，Hybrid Hybridomics. 2003,22: 245-57)。CD6 分子属于清道夫受体富含半脱氨 酸（SRCR)超家族 B (Martinez et al.,化armacol Rev. 2011,63: 967-1000)，与 T细胞 活化有关，是治疗自身免疫性疾病的一个潜在祀点（Alonso-Ramirez et al.，Arthritis. 2010，2010: 130646)。Itolizum油did不抑制可溶性ALCAM与肥K293细胞表达的CD6的 结合（Alonso et al., Hybridoma (Larchmt). 2008, 27: 291-301)。但是，它分别通过 抗-CD3抗体和可溶性ALCAM破坏CD3 / CD6同时祀向外周血单核细胞（PMBC)增殖的协同 效应。CD6共刺激增强CD3活化的PMBC肿瘤坏死因子（TNF)超家族和干扰素（IFN) -g基因 的转录，表明可促进促炎症。在CD6介导的激活途径中，Itolizumab抑制胞内蛋白质磯酸 化的刺激反应，如促分裂原活化蛋白激酶(MPK)、转录3 (STAT3)的信号传导和活化、蛋白 激酶Akt;减少 IFN-丫、比-6 和 TNF-a 生成（化iretal.，Cli址xpimmunol. 2010，162: 116-30)。
[0009] 在类风湿性关节炎患者的I期临床试验中，施用Itolizumab是安全的，并且不影 响白细胞和淋己细胞数量，结果显示Itolizumab对疾病有控制趋势（Ro化iguez et al., Results Immunol. 2012，2: 204-11)。对重度银屑病患者进行I期临床试验，观察也得到 类似的结果，外周血单个核细胞增殖和IFN-g-分泌细胞W及血清中的促炎细胞因子减少 (Krupashankar DS et al. , 2014, J Am Acad Dermatol 71(3): 484-492)〇
[0010] 生产Itolizum油的重组骨髓瘤细胞Tlh/3E9适应在无蛋白质培养基中生长 (W02004/038010 A1)。但是该种细胞系在细胞密度高于2xl06cell/ml时