Pcr中具有减少的硬件和要求的多重化和定量的利记博彩app
【专利说明】PCR中具有减少的硬件和要求的多重化和定量
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求在2012年8月3日提交的“PCR中具有减少的硬件和要求的多重化(multiplexing)和定量”的美国临时申请号61/679，547的优先权，其在此通过引用以其整体并入。
技术领域
[0003]本公开涉及生物化学技术领域，且更具体地涉及在多重实时定量聚合酶链式反应(qPCR)技术中使用的方法和算法。
[0004]背景
[0005]实时定量聚合酶链式反应(qPCR)中的多重化允许在单个qPCR测定中检测和定量不同的扩增靶(例如扩增子)，因此节约了样品材料(例如酶、核苷酸等)并避免了如果通过将样品分开到多个单独的室、孔或管中进行多重化时可发生的孔与孔的变化。通常实现多重qPCR需要针对每个不同扩增子具有不同的光谱(例如发射波长)的报告物(reporter)和检测每个不同光谱的不同检测通道。在一个特定情况下，特定报告物(例如靶特异性探针)被用于允许使用相同发射光谱(例如波长)的多重qPCR，因此减少了检测发射所需的硬件(例如减少数目的检测通道)。根据本公开的教导，允许通过使用例如简单非特异性染料(例如嵌入染料)和相同发射光谱在单个通道检测中的多重qPCR和定量，因此提供了简单并有成本效益的多重化和定量解决方案。
[0006]摄述
[0007]根据本公开的第一方面，提供了方法，该方法包括:使用产生对应于多种不同扩增子的加和幅度信号(a sum amplitude signal)的单通道检测器，检测在多重扩增反应期间产生的多种不同扩增子；定量多种检测的不同扩增子，以及验证多种检测的不同扩增子，其中该定量和该验证包括使用产生的加和幅度信号的数学分析。
[0008]根据本公开的第二方面，提供了用于分析多重扩增反应的基于处理器的硬件分析仪，其中基于处理器的硬件分析仪被配置以基于提供的对应于多重扩增反应的多种不同扩增子的加和幅度信号的数字表示，定量和验证多重扩增反应。
[0009]附图简沐
[0010]被并入并构成该说明书的一部分的附图，阐述了本公开的一个或更多个实施方案，并与示例的实施方案的描述一起用于解释本公开的原理和实施。
[0011]图1A-1D显示了在具有两种扩增子的多重反应的幅度曲线(amplitude curve)之间的多种可能关系。
[0012]图2显示了根据本公开的用于单色检测多重反应的算法的流程图。
[0013]图3显示了两种扩增子的示例性加和解链曲线和其与每种扩增子相关的两个组成解链曲线(constituent melt curve)。
[0014]图4显示了具有彼此接近的循环阈值(Ct)点的两种扩增子的示例性扩增曲线。
[0015]图5A和5B分别显示了扩增过程的典型三步和两步温度循环以及与扩增的扩增子相关的解链温度。
[0016]图6B显示了根据本公开的在图6A中描绘的三步循环的修改的温度循环的实施方案，其中在扩增子的不同解链温度附近的过渡区域的区段被修改为具有较不陡的斜率，过渡区域是循环的温度的斜降(ramping down) ο
[0017]图7A和7B相当于在两步循环情况下的图6A/6B且其中过渡区域是循环的温度的斜升(ramping up)。
[0018]图8显示了 SYBR Green和Alexa Fluor染料的激发和发射光谱，以及用于检测两种染料的发射光谱的部分的宽检测滤波器。
[0019]图9显示了根据本公开的实施方案可被用于表示多重扩增过程的估计模型。
[0020]图10显示了在两个归一化曲线之间和两个非归一化曲线之间的最小累积逐点距离(minimum cumulative point wise distance)中的误差。
[0021]图11是用于单色检测多重扩增反应的处理器控制的硬件的示例性实施方案。
[0022]
[0023]根据本公开的若干实施方案，公开了用于多重化和定量测定的方法和算法。此类方法和算法可与可在扩增期间测量全部或靶扩增子浓度的任何技术联合使用，所述技术包括但不限于可定量总的或特定DNA的量的具有荧光检测、电化学检测或任何其他实时检测技术的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)。
[0024]对于定点护理(Point of Care，POC)应用，单色多重化设备(a single colormultiplexing instrument)(例如，检测单发射波长，单通道检测)与多色设备相比具有更简单、更紧凑和制造更廉价的益处。由于此单色多重化设备可更有效地收集发射光且因此减少观察对应信号所需的时间，它也是更快速的。技术人员将知道当前的多色设备具有使用每种颜色的专用检测通道的额外复杂性，其中每个检测通道可包括单独的激发光源、反射器、激发滤波器、专用的光学元件(例如棱镜、光栅、色散元件等)和窄带(例如带通)发射滤波器，以检测不同的发射光谱同时摈弃设备中所用的其他光谱。由于多重实时qPCR中所用的染料的重叠发射光谱，带通滤波器典型地被用于区分多种发射的光谱带，而从染料发射的部分未被用于减少光谱重叠，因此可获得较不有效的检测，其可需要更长积分(integrat1n)时间。
[0025]根据本公开的一些实施方案，可通过使用在发射侧具有更宽的带宽的吸收滤波器、干涉滤波器或滤波器的组合来制备单色(例如单检测通道)多重化设备，例如可使用更大部分的发射光谱(例如更宽范围的波长)以检测扩增过程，其可转而增加检测的信号强度并因此减少积分时间同时执行荧光检测。根据本公开另外的实施方案，此单色多重化设备可被用于检测、定量和验证在与用于每种扩增子的不同染料和/或探针/引物相关的不同波长峰下发射的扩增子。在一些情况下，仅检测与扩增子相关的部分发射光谱，其可在扩增过程的定量阶段期间被考虑进去。
[0026]用于疾病的测试在多种应用中是非常有用的。然而，为了确保反应的质量，阳性和阴性对照对于确定是否存在污染以及是否适当地发生扩增是有用的。通过在一个孔(例如套筒(cartridge)，反应容器)中进行qPCR，人们可使流控技术(fluidic)设计变得容易、节约试剂成本、以及减少误差和污染。减少误差和污染可转而消除对在单独的孔中添加阳性和阴性对照的需求。在冻干的试剂的情况下，仅需添加洗脱的DNA且反应可在一个室中运行。
[0027]根据本公开的实施方案可与用于检测扩增子浓度的多种定量方法联合使用，所述方法使用例如在测定中与任何双链DNA(double string DNA)结合的嵌入染料，或与使用附接到仅与靶DNA链结合的特异性引物(例如Promega Plexor引物)的荧光团的方法联合使用。使用例如杂交探针诸如水解探针、分子信标、荧光共振能量转移(FRET)、杂交等……的多种其他检测方法以及电化学方法和电泳方法与根据本公开的多个实施方案相容。
[0028]根据本公开的多个实施方案允许在以下情况下多种靶(例如不同的靶)的多重检测和定量(例如允许更大的多重化):
[0029]a.使用单激发(例如单一波长)的用于不同靶的单一荧光团(例如单一发射波长)。在此类实施方案中，相同荧光团且因此单检测器可与不同序列特异性引物一起使用并从而检测不同的扩增子。
[0030]b.使用单激发的用于不同靶的不同荧光团(例如不同发射波长)(例如可使用单一激发波长被全部激发的FRET探针)。
[0031]c.使用多激发波长与单检测器和单发射滤波器的用于不同靶的不同荧光团。单发射滤波器可以是更宽的带宽滤波器以允许包含来自多种荧光团(例如染料)的发射信号的更大部分，以获得发射强度的等价加和。
[0032]d.使用多激发波长与多个检测器和发射滤波器的用于不同靶的不同荧光团。
[0033]根据本公开的多个实施方案还允许使用DNA结合染料(例如荧光)如SYBR Green和FAM，或与特异性靶结合的探针、引物附接的荧光团或其他DNA结合探针。在根据本公开另外的实施方案中，还提供了在扩增过程(例如qPCR)期间的多个点处而不是仅在退火或延伸阶段结束时的基于荧光对温度曲线的分析的多重化和定量。
[0034]根据本公开的多个实施方案还描述了用于通过使用例如单发射波长获得(例如扩增子的)多个(例如不同的)定量的方法。应当注意的是，扩增子从包含不同靶(例如DNA序列或RNA序列)的相同测定中获得。还应当注意的是，为了清楚起见，展示了通过两种不同靶的扩增获得的两种不同扩增子的示例性情况。两种扩增子的此类示例性情况不应当被认为是对展示的实施方案的限制，而是作为如本文所公开的发明构思的示例性情况。
[0035]靶基因或序列的扩增技术被用于确定(例如定量)靶基因或序列的初始浓度。如技术人员已知的，此初始浓度被称为循环阈值(Ct)或通过其被鉴定，所述循环阈值(Ct)通过扩增曲线中对应于扩增循环(例如qPCR温度循环)的扩增子的可检测浓度的可检测初始拐点被定义。然后，检测的Ct值可与先前已知的浓度关联以推导出靶基因的浓度，由此完成定量过程。典型地，Ct值的推导在确定成功(例如适当的)扩增反应之后进行，所述成功(例如适当的)扩增反应可通过对扩增子进行例如终点解链曲线分析或使用阳性和阴性对照被验证(例如验证过程)。在其中两种不同扩增子被扩增(例如两种不同靶基因)的示例性情况下，终点解链曲线分析可确定单特异性扩增子是否被扩增，两种扩增子是否都被扩增或扩增子是否都未被扩增。在成功扩增中，所述成功扩增也被称为适当反应，如果针对两种扩增子的靶都存在，则两种扩增子都被扩增，并因此人们可继续获得每种扩增子的(^值。在一些情况下，扩增反应(例如产生扩增子)之一为(^值(例如浓度)是已知的对照反应。在其他情况下，两种靶的浓度是未知的。根据本公开的多个实施方案，在两种情况下未知的初始浓度(例如(^值)可通过分析多重反应的幅度曲线来获得，所述多重反应的幅度曲线还被称为加和幅度曲线，所述加和幅度曲线涉及每检测循环扩增子的总数。在一些情况下，加和幅度曲线的分析使用通过分析解链曲线(例如解链曲线分析)获得的信息。根据本申请的若干实施方案，可使用在信号处理、估计理论等领域中的技术人员所熟知的强大的已知数学函数和模型来进行加和幅度曲线和解链曲线的详细分析。
[0036]当使用嵌入染料时，荧光强度与扩增子的长度约成比例(例如扩增子越长，荧光强度越强)。根据本公开的一些实施方案，提供了分析多重扩增子的加和幅度曲线(例如对应于总的检测的强度)的方法，所述方法使得能够推导出每个多重反应的Ct和对应的幅度曲线。此类方法与其中使用了具有附接的荧光团的引物的情况也是相容的。在根据本公开的其他实施方案中，可将与其他引物