利用不对称双链rna特异性抑制kras的方法和组合物的利记博彩app
【专利说明】利用不对称双链RNA特异性抑制KRAS的方法和组合物
[0001] 本发明为分案申请，原母案的申请号为201080024105.0,原案国际申请日为2010 年4月5日，进入中国国家阶段日期为2011年11月30日，原案名称为：利用不对称双链 RNA特异性抑制KRAS的方法和组合物。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请依据美国法典第35篇第119条（e)款要求以下申请的优先权和权益：2009 年4月3日提交的美国临时专利申请No. 61/166, 559 ;2009年4月3日提交的美国临时专利 申请No. 61/166,578 ;2009年4月30日提交的美国临时专利申请No. 61/174,279 ;2009年 4月30日提交的美国临时专利申请No. 61/174, 306 ;2009年11月3日提交的美国临时专利 申请No. 61/257, 810 ;和2009年11月3日提交的美国临时专利申请No. 61/257, 820。本申 请还要求以下申请的优先权：2010年2月11日提交的美国专利申请No. 12/704,256 ;2009 年12月18日提交的美国专利申请No. 12/642,371 ;2009年12月18日提交的美国专利申请 No. 12/646, 404 ;2009年12月18日提交的美国专利申请No. 12/642, 264 ;和2009年9月17 日提交的PCT申请No.PCT/US2009/005214。本申请依据美国法典第35篇第119条（e)款 要求以下申请的优先权和权益：2009年6月3日提交的美国临时专利申请No. 61/183, 815 ; 2009年6月3日提交的美国临时专利申请No. 61/183,818 ;2009年6月5日提交的美国临 时专利申请No. 61/184,735 ;2009年12月11日提交的美国临时专利申请No. 61/285,925 ; 和2010年3月1日提交的美国临时专利申请No. 61/309, 266。上述申请完整教导以引用的 方式并入本文。 发明领域
[0004] 本发明涉及用于研宄、诊断和治疗响应KRAS基因表达和/或活性调节的特征、疾 病和病况的化合物、组合物和方法。本发明还涉及与某些特征、疾病和病况有关的化合物、 组合物和方法，这些特征、疾病和病况响应KRAS基因表达通路或介导此类特征、疾病和病 况的维持或发展的其它细胞过程中所涉及基因的表达和/或活性调节。具体而言，本发明 涉及能够由Dicer酶加工的小核酸分子，例如Dicer底物siRNA(DsiRNA)，其能够介导针对 KRAS基因表达的RNA干扰（RNAi)。这些抗KRASDsiRNA可用于例如提供用于治疗可响应 受试者体内KRAS调节的特征、疾病和病况（例如癌症和/或其它增生性疾病、病症或病况） 的组合物。
[0005] 发明背景
[0006] Ras信号传导调控异常会导致肿瘤生长和转移（GoodsellDS.Oncologist 4:263-4)。据估计，所有人肿瘤中有20% -25%含有Ras激活突变；而且在特定肿瘤类型 中，这一数字高达90%(DownwardJ.NatRevCancer, 3:11-22)。因此，Ras基因家族的成 员是对于癌症治疗设计值得关注的分子靶。
[0007] 三个人RAS基因编码高度相关的188至189个氨基酸的蛋白质，命名为H-Ras、 N-Ras以及K-Ras4A(KRAS同种型a)和K-Ras4B(KRAS同种型b;这两种Kras蛋白由替代 性基因剪接产生）。Ras蛋白可充当二元分子开关，用以控制细胞内信号传导网络。Ras调 控的信号通路控制例如肌动蛋白细胞骨架完整性、增殖、分化、细胞粘附、细胞凋亡和细胞 迀移等过程。在癌症中，Ras和Ras相关蛋白通常失调，导致侵袭和转移增加以及细胞凋 亡减少。Ras激活许多通路，但对于肿瘤发生来说特别重要的一条通路似乎是丝裂原激活 蛋白（MAP)激酶，这些MAP激酶本身会将信号向下游传导到其它蛋白激酶和基因调控蛋 白（Lodish等，MolecularCellBiology(第 4 版）?SanFrancisco:ff.H.Freeman,第 25 章，"Cancer"）。
[0008] 具有链长度为25至35个核苷酸的双链RNA(dsRNA)试剂曾被描述为哺乳动 物细胞中靶基因表达的有效抑制剂（Rossi等，美国专利申请No. 2005/0244858和US 2005/0277610)。认为这种长度的dsRNA试剂由RNA干扰（RNAi)通路的Dicer酶加工，使 得此类试剂被称为"Dicer底物siRNA"（ "DsiRNA"）试剂。先前也曾描述过DsiRNA试剂 的其它修饰结构（Rossi等，美国专利申请No. 2007/0265220)。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明涉及含有双链RNA( "dsRNA"）的组合物及其制备方法。本发明的dsRNA 能够在体外或哺乳动物受试者体内降低细胞中靶KRas基因的表达。更具体来说，本发明涉 及优选的Dicer底物siRNA( "DsiRNA")，其结构和修饰模式经过优化以用作有效且高效的 KRAS抑制剂，任选地具有延长的抑制作用持续时间。此类DsiRNA中绝大多数的靶特异性抑 制效力和功效相对于针对相同靶RNA的21个核苷酸的siRNA都意外地增强。虽然不希望 受理论束缚，但这一增强的活性可能反映了DsiRNA试剂的固有益处，该DsiRNA试剂在RNAi 通路中处于较短siRNA试剂参与RNAi通路的点的上游的点处参与该通路。
[0011] -方面，本发明提供一种分离的双链核糖核酸（dsRNA)，其包含第一和第二核酸链 以及具有至少25个碱基对的双链体区，其中所述dsRNA的第二条链在其3'末端包含1-5 个单链核苷酸，其中当将所述双链核酸引入哺乳动物细胞中时，该第二寡核苷酸链沿第二 寡核苷酸链长度的至少19个核苷酸且最多35个核苷酸与选自由SEQIDNO: 141-186组成 的组的靶KRAScDNA序列充分互补，以降低KRAS靶基因表达。
[0012] 在一个实施方案中，从第一寡核苷酸链3'末端的第一个核苷酸（1位）开始，用经 过修饰的核苷酸取代1位、2位和/或3位。在某些实施方案中，第一条链3'末端的经过修 饰的核苷酸残基是脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸或荧光分子。在相关实施方案中，第一寡核 苷酸链3'末端的1位是脱氧核糖核苷酸。
[0013] 在另一实施方案中，第一条链的3'末端与第二条链的5'末端形成平端。
[0014] 在另一实施方案中，第一条链的长度为25个核苷酸，而第二条链的长度为27个核 苷酸。
[0015] 在一个实施方案中，第二条链包括序列SEQ IDNO:11-50和135-140。
[0016] 在另一实施方案中，第一条链包括序列SEQID N0:5、8和91-134。
[0017] 在另一实施方案中，dsRNA包括第一条链/第二条链的序列对，该序列对是SEQID N0:5/SEQIDN0:14、SEQIDN0:8/SEQIDN0:43、SEQIDN0:132/SEQIDN0:138、SEQID N0:91/SEQIDN0:11、SEQIDN0:129/SEQIDN0:135、SEQIDN0:92/SEQIDN0:12、SEQID N0:130/SEQIDNO:136,SEQIDN0:93/SEQIDNO:13,SEQIDN0:131/SEQIDNO:137,SEQ IDN0:94/SEQIDN0:15、SEQIDN0:133/SEQIDN0:139、SEQIDN0:95/SEQIDN0:16、SEQ IDN0:96/SEQIDNO:17,SEQIDN0:97/SEQIDNO:18,SEQIDN0:98/SEQIDNO:19,SEQ IDN0:99/SEQIDN0:20、SEQIDN0:100/SEQIDN0:21、SEQIDN0:101/SEQIDN0:22、SEQIDN0:102/SEQIDN0:23、SEQIDN0:103/SEQIDN0:24、SEQIDN0:104/SEQID NO:25,SEQIDN0:105/SEQIDNO:26,SEQIDN0:106/SEQIDNO:27,SEQIDN0:107/SEQ IDNO:28、SEQIDNO:108/SEQIDNO:29、SEQIDNO:109/SEQIDNO:30、SEQIDNO:110/ SEQIDN0:31、SEQIDN0:111/SEQIDN0:32、SEQIDN0:112/SEQIDN0:33、SEQID N0:113/SEQIDN0:34、SEQIDN0:114/SEQIDN0:35、SEQIDN0:115/SEQIDN0:36、SEQ IDN0:116/SEQIDN0:37、SEQIDN0:117/SEQIDN0:38、SEQIDN0:118/SEQIDN0:39、 SEQIDN0:119/SEQIDNO:40,SEQIDN0:134/SEQIDNO: 140,SEQIDN0:120/SEQID N0:41、SEQIDN0:121/SEQIDN0:42、SEQIDN0:122/SEQIDN0:44、SEQIDN0:123/SEQ IDNO:45、SEQIDNO:124/SEQIDNO:46、SEQIDNO:125/SEQIDNO:47、SEQIDNO:126/ 5￡〇10勵：48、5￡〇10勵：127/5￡〇10勵：49或5￡〇10勵：128/5￡〇10勵：50。
[0018] 在一个实施方案中，第一条链和第二条链各自的长度是至少26个核苷酸。
[0019] 在另一实施方案中，3'突出的核苷酸包括经过修饰的核苷酸。任选地，3'突出的 经过修饰的核苷酸为2'-0-甲基核糖核苷酸。在相关实施方案中，3'突出的所有核苷酸都 是经过修饰的核苷酸。
[0020] 在另一实施方案中，第一和第二寡核苷酸链中的一者或两者包含5'磷酸。
[0021] 在另一实施方案中，dsRNA的经过修饰的核苷酸残基是2' -0-甲基、2' -甲氧基乙 氧基、2' -氣、2'-條丙基、2' -〇-[2_(甲基氛基）_2_氧代乙基]、4' -硫代、4' -CH2-0-2' -桥、 4' - (CH2) 2-0-2' -桥、2' -LNA、2' -氨基或 2' -0- (N-甲基氨基甲酸酯）。
[0022] 在一个实施方案中，dsRNA的3'突出的长度为1-3个核苷酸。任选地，该3'突出 的长度为1-2个核苷酸。在相关实施方案中，3'突出的长度是两个核苷酸，并且3'突出的 经过修饰的核苷酸是2' -0-甲基修饰的核糖核苷酸。
[0023] 在另一实施方案中，从第二条链的与第一寡核苷酸链5'末端核苷酸残基互补的 核苷酸残基开始，第二寡核苷酸链包含交替的经过修饰和未修饰的核苷酸残基。在另一实 施方案中，从第二条链的与第一寡核苷酸链5'末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，第 二寡核苷酸链在从18位至第二寡核苷酸链5'末端的所有位置包含未修饰的核苷酸残基。
[0024] 在另一实施方案中，第一条链和第二条链各自的长度为至少26个且最多30个核 苷酸。
[0025] 在一个实施方案中，dsRNA在细胞中由Dicer内源性裂解。
[0026] 在另一实施方案中，在细胞环境中，足以降低靶基因表达的分离的双链核酸的量 是1纳摩尔或更低、200皮摩尔或更低、100皮摩尔或更低、50皮摩尔或更低、20皮摩尔或更 低、10皮摩尔或更低、5皮摩尔或更低、2皮摩尔或更低或1皮摩尔或更低。
[0027] 在另一实施方案中，当在体外于哺乳动物细胞中测定时，在细胞环境中有效浓度 为1纳摩尔或更低、200皮摩尔或更低、1