一种微生物菌株及其在降解烟草甾醇中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于烟草降害技术领域，也属于生物强化技术的范畴，具体涉及留醇高效 降解菌在降解烟叶及其衍生产品中留醇的应用。
【背景技术】
[0002] 植物留醇是植物性留体化合物，它不仅是植物细胞的重要组成成分，也是一种重 要的植物活性成分，其基本结构为环戊氢化菲体系。目前烟草中已报道植物留醇主要有胆 甾醇、菜油留醇、豆留醇和谷留醇，霉变烟叶中还可能含有麦角留醇。除游离态留醇外， 甾醇类化合物还以结合态存在，结合态包括与脂肪酸结合成酯、与糖类的羟基形成糖苷。
[0003] 烟草中植物留醇主要存在于细胞膜中，不但能促进烟草生长，而且对烟草的安全、 品质都有较大的影响。有研宄表明烟草中的留醇是卷烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体 物，卷烟烟气中61%的苯并[a]芘是由它裂解产生的。不同于食品和其它植物中的留醇，在 卷烟抽吸时约有20-25%的烟草植物留醇完整的转移到主流和侧流烟气中。留醇中的羟基 高温热解时会与其母体的四轮环戊稀[a ]菲环结构形成稠环芳径化合物。Stedman的研宄 表明豆留醇在750°C下热解生成苯并[a ]芘；Badger等的研宄表明，在豆留醇的裂解过程 中，发生了甾醇骨架的一系列单分子反应后形成了菲、蒽等多环芳烃。
[0004]由于烟草中植物留醇是卷烟烟气中苯并[a]芘生成的前体化合物，降解烟草及 其制品中的植物留醇对促进卷烟的减害降焦研宄具有重要的参考价值和实践意义。
[0005] 相关研宄表明：节杆菌、诺卡氏菌和分枝杆菌均可切除留醇的饱和侧链，得到雄 甾-1，4-二烯-3, 17-二酮（ADD)，并且它们对留体化合物的降解作用并不停留在ADD上，大 多数野生菌株可以降解ADD直至最终产物C0 2，完全降解留醇母核需要20多种酶参与反应， 其反应式如图1所示。这为开展烟草中植物留醇降解研宄奠定了良好的理论基础。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在筛选、培养条件优化及研发出烟草留醇的高效降解微生物 Acinetobacter pittii TQ30002菌株、菌剂，并用于降解烟草材料中的留醇，以实现处理上 的温和性与低成本。
[0007] 本发明采用的技术方案如下：
[0008] 一种留醇降解菌株（Acinetobacter pittii) TCD0002,已于 2014 年 10 月 8 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 9752。
[0009] 所述的甾醇降解菌株（Acinetobacter pittii)TQ)0002在降解甾醇中的应用。
[0010] 上述技术方案中所述的留醇为烟叶及其衍生产品中的甾醇。
[0011] 所述的留醇降解菌株（Acinetobacter pittii)TQ)0002在降解留醇中的应用，包 括如下步骤：
[0012] 步骤（1)，斜面培养：将留醇降解菌株T⑶0002于斜面培养基上培养，培养温度为 28°C，培养时间为7d ;然后用无菌水将斜面表面生长的菌苔用接种环刮洗，制备成第一菌 悬液；
[0013] 步骤（2)，扩繁培养：将步骤（1)得到的第一菌悬液接种至扩繁培养基上进行扩繁 培养，接种量为5%，培养温度为28°C，培养时间为7d;
[0014]步骤（3)，降解应用：将步骤（2)培养的留醇降解菌株T⑶0002制成第二菌悬液， 然后喷洒到烟叶及其衍生产品中进行降解。
[0015] 上述技术方案中步骤（1)所述的斜面培养基为：NaCl 1. 5g，K2HP04 1. 5g，NaN03 4. 5g，FeS04 ? H20 0? 0075g，MgS04 0? 3g 和 1. Og/L 豆甾醇乳浊液 150mL，琼脂 30g，一起加入 至自来水中定容成1. 5L，调整pH = 7. 0,加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞lOmL玻璃 试管内，每管分装量为4mL，接着121°C灭菌30分钟，然后放置成斜面，冷却至室温，即得。
[0016] 上述技术方案中步骤（1)所述的第一菌悬液浓度为109CFU/mL。
[0017] 上述技术方案中步骤（2)所述的扩繁培养基为：NaCl 1. 5g，K2HP041. 5g，NaN03 4. 5g，FeS04 ?H20 0?0075g，MgS040?3g，1. Og/L 豆甾醇乳浊液 150mL 和琼脂 30g，一起加入 至自来水中定容成1. 5L，调整pH= 7. 0,加热煮沸，待琼脂融化后，分装至带棉塞500mL三 角瓶，每瓶分装量为100mL，接着121°C灭菌30分钟，冷却至室温，即得。
[0018] 上述技术方案中步骤（3)所述的第二菌悬液浓度为109CFU/mL。
[0019] 上述技术方案中步骤（3)所述的降解应用是将每50mL菌悬液喷洒至1000g烟丝 上，然后将其放置于恒温恒湿培养箱内，于温度为28°C，湿度为60%培养48小时后，50°C烘 干20分钟，即可。
[0020] 上述技术方案中步骤（3)所述的降解应用是每lmL菌悬液接种100mL烟浸膏稀 释液，然后放置于恒温摇床，于28°C下180rpm培养48小时，减压浓缩，50°C烘干，即可；所 述的烟浸膏稀释液是将烟浸膏用自来水稀释5倍得到的。
[0021] 本发明利用烟草种植区的土壤、根腐病烟株的根部及叶片的微生物细菌群，通过 豆甾醇为唯一碳源诱导底物的培养基进行分离，再采用筛选验证，菌株对烟草留醇具有良 好降解性能。
[0022] 同时，通过进一步采用工业烟叶产品进行菌剂处理，以未经过微生物菌剂处理的 工业烟叶为空白对照，比较菌剂在工业烟叶产品留醇降解处理工艺上的应用效果。
[0023] 本发明与现有技术相比，其有益效果为：
[0024] 本发明微生物菌株为留醇降解菌株T⑶0002,保藏编号为CGMCC No. 9752,该菌株 可用于工业烟草及其衍生产品留醇类物质降解，反应条件温和，成本低，效率高，不会对环 境造成二次污染。具体应用方式有：（1)为相关烟草企业提供特效留醇降解菌剂，用于处理 烟叶留醇降解，降低留醇含量，减少留醇物质在燃烧过程中形成的有害物质含量；（2)为相 关烟草企业提供特效留醇降解菌剂，用于处理烟叶衍生产品-烟浸膏中留醇降解，降低甾 醇含量，减少留醇物质在燃烧过程中形成的有害物质含量，实现烟草产品减焦降害的目的。
【附图说明】
[0025] 图1是豆留醇的微生物降解途径的反应式；
[0026] 图2是HPLC分析豆甾醇的标准曲线；
[0027]图3是菌株Acinetobacter pittii TQ30002降解豆留醇HPLC分析谱图；其中， 12. 58min为豆甾醇的峰，其峰面积为15767. 8;
[0028] 图4米用邻接法构建基于菌株Acinetobacter pittii_TCD0002的16S rRNA基因 部分序列构建系统发育树；
[0029] 图 5 是菌株 Acinetobacter pittii TCD0002 的扫描电镜图；
[0030] 图6是麦角留醇标准工作液HPLC色谱图；
[0031] 图7是0 -谷留醇标准工作液HPLC色谱图；
[0032] 图8是豆留醇标准工作液HPLC色谱图；
[0033] 图9是胆留醇标准工作液HPLC色谱图；
[0034] 图10是实施例2中样品HPLC色谱图；
[0035] 图11是实施例3中样品HPLC色谱图；
[0036] 其中，1-内标物（6-酮胆甾烷醇），2_麦角甾醇，3-胆甾醇，4-豆甾醇，5-0-谷甾 醇；
[0037] 留醇降解菌株（Acinetobacter pittii) TCD0002,已于2014年10月8日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 9752,保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0039] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发 明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的 常规产品。
[0040] 实施例1.菌株T⑶0002分离及降解留醇性能筛选
[0041] (1)以豆甾醇为唯一碳源的富集、筛选培养基配制
[0042] NaCl 1. 5g，K2HP04 1. 5g，NaN03 4. 5g，FeS04 ? H20 0? 0075g，MgS04 0? 3g 和 1. Og/L 豆甾醇乳浊液150mL，一起加入至自来水中定容成1. 5L，pH = 7. 0,分装至带棉塞500mL三 角瓶（每瓶分装量为l〇〇mL)，121°C灭菌30分钟，自然冷却到室温，得到富集培养基，待用。
[0043] (2)甾醇降解菌的富集培养
[0044] 富集培养时称取1克烟田土壤、烟叶或烟根部，加入到装有100mL富集培养基的三 角瓶中，置于28°C恒温摇床中培养。次日起每天取样，显微镜下观察菌体生长情况，选择有 微生物生长明显的样品涂平皿培养，待有单菌落长出时，挑取单菌落转入斜面保存。
[0045] (3)甾醇降解菌的初步筛选
[0046] 经选择性培养基的富集培养、显微镜观察生物量来进行留醇降解菌的初步筛选。 将培养后生物量很大的样品进行稀释后涂平皿分离，分离得到单一的纯菌株斜面保存、编 号。将分离得到的菌株转接到装有l〇〇mL液体培养液的三角瓶中培养，每瓶接种1支菌株斜 面。不接菌空白培养基设为对照。每个菌株2个平行，培养温度为28°C，转速为200r/min， 豆甾醇浓度为〇. 1%。
[0047]所述的液体培养液为：NaCl 1. 5g，K2HP04 1. 5g，NaN03 4. 5g，FeS04 ? H200. 0075g， MgS04 0. 3g，1. Og/L豆甾醇乳浊液150mL，一起加入至自来水中定容成1. 5L，调整pH = 7. 0， 分装至带棉塞500mL三角瓶（每瓶分装量为100mL)，121°C灭菌30分钟，自然冷却到室温 即可。
[0048] 培养5d后每个样均用移液枪吸取培养液0. 5-1. 5mL到离心管内，同时吸取相同体 积的分析纯氯仿加入到离心管，充分混匀萃取，去除水层部分。氯仿部分用毛细管半定量吸 取，TLC薄层板上以0. 01%豆留醇为对照逐个点样，以体积比为1:1的氯仿和石油醚的混合 溶剂作为展开剂扩展，之后用5%硫酸-乙醇的显色剂喷洒后加热显色。将不接菌空白培养 基氯仿提取物设为空白对照。
[0049] 试验结果表明，从烟叶和烟田土壤分离的54株细菌中，筛选获得可降解豆留醇的 菌株T⑶0002。与空白对照相比，即与不接菌空