一种用于提高莱茵衣藻脂肪酸含量的转基因衣藻、构建方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域，涉及将外源基因优化改造后转入莱茵衣藻基 因组中并提高莱茵衣藻脂肪酸含量的方法，尤其涉及一种用于提高莱茵衣藻脂肪酸含量的 转基因衣藻、构建方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 目前，全球大约80 %的能源来自于化石燃料，作为一种不可再生能源，化石燃料逐 渐枯竭，它的消耗殆尽成为人们面临的重大问题，并且化石燃料的大量使用引起了气候变 暖、环境污染、健康等一系列问题。化石燃料的使用是全球变暖的主要原因之一，化石燃料 作为一种能量来源，应该被一种可再生的，清洁的能源所替代，以便减少温室气体的排放， 长期依赖化石燃料，不利于长久的可持续发展。所以当务之急是找到可再生、低污染的新型 可替代能源。在众多的可替代能源中，生物燃料最受关注，而生物柴油是常用的生物燃料之 〇
[0003] 生物柴油现已被各国认为是理想的可再生能源，其主要成分是脂肪酸甲酯 (FAME)，是以可再生资源为原料通过酯交换制备而成，具备与石化柴油相近的性能。其 优势如下：1.可持续供应的可再生资源；2.具有高度生物降解性，毒性小；3.基本不会增 加对环境有害的化学物质排放；4.有较高的氧含量，比来自石油的柴油有更大的燃烧值； 5.能逐步缓解对进口资源的依赖性；6.生物柴油来源于植物的光合作用，可以缓解生物柴 油燃烧所生成的C0 2，所以无论是生产还是使用生物柴油均不会造成温室效应。生物柴油 的发展历程主要分为三个：第一代生物柴油的原料主要是油菜、大豆、棕榈油和向日葵，而 这些主要是食用油的来源，对全球的食品市场和食品安全产生了影响，同时，培养第一代生 物柴油作物需要大面积的土地进行种植，来供应燃料需求，这造成大量森林被砍伐，导致生 态失衡。第二代生物柴油原料主要是麻风树、麻花、烟草种子、三文鱼油、废烹调油、餐厅油 脂和动物脂肪等，这些原料部分改善了与人争粮，与人争地的现象，所产出的生物柴油更高 效、更环保。但是它同样存在一些问题，比如说，来源不够广泛，无法满足燃料的需求以及饱 和脂肪酸含量过高等缺点。原料的低效率和不可持续性，使得人们进一步寻找理想的生物 原料。第三代生物柴油原料，是微藻，它具有较高的光和效率生长速度，具有高油脂含量的 微藻生产油脂的能力远高于传统农作物，微藻巨大的产业价值使得它成为近年来的研宄热 点。
[0004] 微藻产油主要分为两部分，分别是自由脂肪酸合成和三酰甘油合成（即kennedy 路径），两个路径分别发生在质体和细胞质中，在质体中生成自由脂肪酸后，被转运到质体 外进行三酰甘油合成。藻细胞中的糖酵解路径为脂肪酸合成提供原材料乙酰辅酶A，乙酰辅 酶A在乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，AC-Case)的催化下生成丙二酸单酰 辅酶A，这步反应是不可逆的，是脂肪酸合成的关键步骤。在脂肪酸合酶的作用下生成自由 脂肪酸，自由脂肪酸从质体中进入细胞质的内质网上开始三酰甘油的组装。主要是三种酰 基转移酶甘油3-磷酸酰基转移酶（GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT)和二酰甘油酰基 转移酶（DAGAT)起作用。微藻中脂肪酸合成路径如图1所示。
[0005] 美国能源部在1978年立项研宄生物柴油方面，他们从海洋和湖泊中分离出3000 株微藻，并从中筛选出大约300株生长速度快、脂肪酸含量高的微藻，包括硅藻、绿藻、蓝藻 等。根据目前的报道，微藻的脂含量占干重的比例在1%~70%之间，在某些培养条件下 可达90 %。要使微藻产油量提高，通常都是胁迫条件，这种条件下，微藻在提高含油量的 同时，生长会受到影响。所以很多研宄人员致力于基因改造方面，1991年美国能源部开展 了利用基因工程构建高产油微藻的研宄。在微藻脂肪酸合成路径以乙酰辅酶A为底物，在 乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-coenzyme A carboxylase，ACCase)的催化下进入后续合成路 径，ACCase是脂肪酸生物合成中的关键限速酶，1995年Dunahay T G等人成功将ACCase 车专入小环藻中(Dunahay T G, Jarvis E E, Roessler P G. Genetic transformation of the diatomsCyclotella crypticaandNavicula saprophila. J Phyco,1 1995,31:1004 ~ 1012)。近年来，很多蓝藻和大肠杆菌的ACCase基因序列在GenBank数据库中公布，目前未 见到关于利用ACCase显著提高微藻脂肪酸含量的报道。
[0006] 在提高脂肪酸代谢速率时，抑制分支代谢路径也是一种方法，PEPC催化C02与磷 酸烯醇式丙酮酸（PEP)的羧化反应，生成草酰乙酸（0AA)和无机磷酸，PEP可转化成乙酰 CoA，后者是脂肪酸合成的主要原料。PEPC在碳代谢途径中将碳源导向三羧酸循环，使得碳 源流向非脂类积累的方向而不易于油脂的积累。1999年Chen等人发现，油菜籽中的pepc 沉默后，其产油量提高了 6. 4-18% (陈锦清，郎春秀，胡张华等.反义p印c基因调控油菜 籽粒蛋白质/油脂含量比率的研宄丄农业生物技术学报.，1999,7(4):316-32)。此外，他 还提出"底物竞争"假说，认为籽粒油脂和蛋白质合成时均需要同一底物一丙酮酸，两者存 在底物竞争，而其竞争性取决于两类物质代谢的关键酶活性高低，即PEPC和乙酰辅酶A羧 化酶（ACCase)的相对活性。研宄发现，微藻脂肪酸含量与pepc酶活性成反相关，所以近年 来多应用RNA沉默技术探宄其对微藻莱茵衣藻和海洋硅藻三角褐指藻的影响。利用RNAi 技术使p印c2基因沉默后，莱茵衣藻（C.Reinhardtii)的油脂含量提高了 14-28%。结果初 步显示抑制PEPC酶活性，可以显著提高微藻脂含量，效果较明显。
[0007] 近年来关于三酰甘油组装路径相关基因的研宄也逐渐展开，关于这些酶的研宄主 要集中在拟南芥、油菜等高等植物、大肠杆菌、酵母和部分藻类中，不同物种中相关酶的存 在形式有差异。甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT)在TAG合成中也是一种重要的酶。据报 道，将大肠杆菌和红花（saflower)的GPAT基因转移到拟南芥中，使得种子的含油量和重量 都有所增加，含油量最多增加了 22%。甘油二酯酰基转移酶（DAGAT)是一种完整的内质网 细胞微粒体酶。它是三酰甘油合成的最后一个酶，催化二酰甘油（DAG)生成三酰甘油，同 时也是反应的限速酶。最早关于DAGAT影响产油量的报道是2001年，Jako等人将DGAT的 cDNA在野生型拟南芥中过量表达，结果DGAT活性增加了 10% -70%，种子含油量也有所增 加。后来Zhang等用特异性hpRNA使得烟草中DGAT1基因沉默，结果烟草种子的含油量下 降了 9%-49%。这说明，一些高等植物中油脂含量与DGAT表达量关系密切。相比前面几 个基因，对于油脂产量的提高效果不明显或者不稳定。关于甘油-3-磷酸脱氢酶（G3PDH)， 它负责催化甘油-3-磷酸的形成，将一种胞质酵母的甘油-3-磷酸脱氢酶基因转化到油菜 (B.napus)种子中，结果使得产油率提高40%。在藻类中关于这几种基因的报道主要是莱 茵衣藻，Hexin Lv等人在莱茵衣藻脂肪酸积累时，利用转录组进行分析，发现超过2500种 基因的上调，其中LPAAT和DAGAT被抑制后，脂肪酸产量下降。甘油-3-磷酸脂肪酰转移酶、 溶血磷脂酸酰基转移酶、或者甘油二酯酰基转移酶（DAGAT)对应基因的过表达都可以使植 物脂肪酸产量提高，由此可以推测TAG形成过程中的酶同样可以影响微藻中脂肪酸含量。
[0008] 莱茵衣藻（Chlamydomons reinhardtii)属于绿藻门团藻目衣藻科，是一种单细胞 真核鞭毛藻类，细胞呈卵形，有细胞壁，细胞质和细胞核。胞质里有一个大型杯状叶绿体，占 整个细胞体积的40 % -60 %。莱茵衣藻细胞的前端有两根鞭毛，可摆动，能在水中自由游 动，可诱导光照和其它条件都适宜的地方，进行光合作用，因其与酵母细胞有许多共同的特 征，又被称为"光合酵母"。莱茵衣藻有无性生殖和游行生殖两种生殖方式，有光能自养、异 养及光能异养3种不同的营养方式，其生长周期短，光合效率高，并且遗传背景清晰。虽然 LPAAT和DAGAT在TAG合成中具有重要的功能，但国内外关于LPAAT和DAGAT在莱茵衣藻中 的功能研宄很少，尚未有关于它们在莱茵衣藻转化、表达的研宄，更未见它们对莱茵衣藻脂 肪酸合成影响的研宄。
【发明内容】
[0009] 本方法的目的就是提供一种提高莱茵衣藻脂肪酸含量的转基因衣藻。
[0010] 为实现上述目的，本发明提供一种用于提高莱茵衣藻脂肪酸含量的转基因衣藻的 构建方法，步骤如下：
[0011] 获得溶血磷脂酸酰基转移酶基因和甘油3-磷酸酰基转移酶基因；
[0012] 分别构建溶血磷脂酸酰基转移酶基因重组表达载体和甘油3-磷酸酰基转移酶基 因重组表达载体；
[0013] 将所述溶血磷脂酸酰基转移酶基因重组载体和甘油3-磷酸酰基转移酶基因重组 载体分别或者共同转化至莱茵衣藻细胞中，得到转溶血磷脂酸酰基转移酶基因和/或甘油 3-