肿瘤坏死因子α因子蛋白的全序列及其蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肿瘤坏死因子a因子蛋白的全序列及其蛋白的制备方法，尤其 涉及一种池蝶蛘的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子a因子（Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)蛋白的全序列及其蛋白的制备方法,属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 脂多糖诱导的肿瘤坏死因子 a 因子（Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)是一种转录因子，它可调控肿瘤坏死因子TNF-a转录表达，引起多种炎症反 应和肿瘤细胞发生细胞凋亡。
[0003] 我国是水产养殖大国，以池蝶蛘等为育珠蛘的珍珠养殖是我国水产养殖的主导产 业之一。池蝶蛘等淡水贝类具有个体大、营养丰富等特点，其提取物还具有免疫调节、抗癌 等多种生物学活性效应。目前国内外已通过提取贝类多糖等生理活性物质，开发出了保健 食品和药品。但以上提取物由于贝类体内本身含量低等原因，以及提取制备步骤繁琐、工艺 复杂等原因，目前多为纯度较低的多糖等物质的混合物，具有一定免疫调节等功效，但对肿 瘤细胞的毒性作用较低，对其功效及副作用药理和毒理研究尚缺乏认识。而利用现代基因 工程技术开发的池蝶蛘中LITAF重组蛋白产品，对人类来源的肿瘤细胞如A549等细胞株具 有特异性和安全性高、杀伤性好、来源稳定和易于贮存等优点，并具有广阔的市场前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供了一种池蝶蛘的脂多糖诱导的肿瘤坏死因子a因子 (Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor, LITAF)蛋白的全序列及其蛋白的制 备方法，通过设计扩增池蝶蛘中LITAF开放阅读框序列的寡核苷酸引物，获得了池蝶蛘中 LITAF蛋白的全序列。
[0005] 为了达成上述目的，本发明的解决方案是：一种肿瘤坏死因子a因子蛋白的全序 列，具有序列表中SEQ ID NO. 1所示的来自于a因子体内的LITAF蛋白的核酸全序列和具 有序列表中SEQ ID N0. 2所示的来自于a因子体内的LITAF蛋白的氨基酸序列。
[0006] 肿瘤坏死因子蛋白的制备方法，包括如下步骤：提取池蝶蛘的总RNA，反转录 成cDNA后，以该cDNA为模板，利用设计好的寡聚核苷酸引物序列，进行聚合酶链式反应 (PCR)，得到编码LITAF蛋白的基因全序列；构建重组表达载体pET-32c (+)-LITAF，转化大 肠杆菌感受态BL21 (DE3)，经鉴定为阳性后，在体外利用0. lmmol/L异丙基-P-D-硫代吡 喃半乳糖苷（IPTG)于30°C诱导LITAF蛋白表达；最后分离纯化目的蛋白，获得LITAF重组 蛋白，所制备得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO. 1所示的来自于池蝶蛘体内特有的LITAF 蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO. 2所示的来自于池蝶蛘体内特有的LITAF蛋白的氨基酸序 列。
[0007] 所述步骤具体为：
[0008] 1)以池蝶蛘的cDNA为模板，设计扩增LITAF基因的引物，利用该引物进行聚合酶 链式反应，得到编码LITAF蛋白的基因全序列；
[0009] 2)利用基因重组技术将LITAF基因片段克隆到PMD19-T载体中，再经限制 性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-32c(+)原核表达载体相连接，获得表达重组载体 pET-32c (+) -LITAF ;该重组载体转化大肠杆菌感受态BL21 (DE3)，经扩大培养，利用PCR法 筛选、鉴定阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体pET-32c(+)-LITAF ;
[0010] 3)取阳性重组质粒pET-32c(+)-LITAF，在体外利用0? lmmol/LIPTG于30°C，6h诱 导LITAF蛋白表达；利用Western-blot和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定目的蛋白；[0011] 4)用组氨酸亲和层析柱法分离纯化目的蛋白，从而获得LITAF重组蛋白。
[0012] 本发明的有益效果为：本发明设计了扩增池蝶蛘中LITAF编码序列的寡聚核苷酸 引物，获得了池蝶蛘中LITAF蛋白的全序列，所得到的LITAF重组蛋白是利用基因工程技术 开发的池蝶蛘中LITAF蛋白产品，对人类肿瘤细胞A549等多种肿瘤细胞具有细胞毒性强、 特异性高、安全性好、可大量重复生产和易于贮存等优点，LITAF重组蛋白可用于制备新型 基因工程抗癌药物，防治人类癌症，具有广阔的市场前景。
【具体实施方式】
[0013] 下面实施例对本发明做进一步骤的说明。
[0014] 本实施例的一种肿瘤坏死因子c[因子蛋白的全序列，具有序列表中SEQ ID NO. 1 所示的来自于池蝶蛘体内的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQ ID NO. 2所示的 来自于池蝶蛘体内的LITAF蛋白的氨基酸序列。
[0015] 一种肿瘤坏死因子蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0016] 1. LITAF基因序列的PCR扩增：取池蝶蛘的外套膜组织，加液氮研磨后，用 TRIzol法（立菲生物，美国）提取池蝶蛘的总RNA，利用反转录试剂盒（立菲生物，美 国）进行反转录，获得池蝶蛘的cDNA。以该cDNA为模板，设计扩增LITAF蛋白基因 的引物，进行聚合酶链式反应，PCR扩增反应的参数为：94°C预变性5min ;35个循环： 94°C 40sec, 56°C 40sec, 72°C lmin ;72°C 10min ;得到编码 LITAF 蛋白基因的全序列。
[0017] 2.重组表达载体pET-32c(+)-LITAF的构建：将得到的PCR产物与pMD19-T载体 (TAKARA，日本）相连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞（TAKARA，日本)，涂布到含氨苄青 霉素的LB筛选平板（四季青，中国），经10h培养后，挑取若干个菌落进行PCR鉴定，PCR反 应参数和条件同上；取一经鉴定过的阳性克隆扩大培养，以碱裂解法抽提质粒，将纯化后的 质粒以Hind I和BamH I限制性内切酶（上海生工，加拿大）双酶切，再插入经过同样双酶 切的pET-32c (+)载体（Novagen，美国）的相应位点上，转化大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3) (天根，德国）。利用PCR法筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体 pET-32c(+)-LITAF。
[0018] 3.重组蛋白的表达与鉴定：将阳性重组质粒pET-32c(+)-LITAF
[0019] 转化表达宿主菌BL21 (DE3)(天根，德国）感受态，涂布含氨苄青霉素的LB (四季 青，中国)平板，37°C倒置培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LB培养液（四季青，中国)， 37°C振荡培养10。取适量菌液，按1:100的比例扩大培养至0D600为0. 4-0. 5时，将菌液 分为若干等份，不加或分别加入IPTG (上海生工，加拿大）（终浓度在0-1. 0mm〇l/L)，继续培 养6h，离心法收集菌体。细菌经超声波裂解后，离心分离上清液和沉淀，再分别上样，进行 SDS-PAGE电泳（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）鉴定目的蛋白。
[0020] 4.重组蛋白的纯化与抗体制备：利用组氨酸亲和层析柱（Novagen，美国）对表达 产物进行分离纯化。用上述方法大量制备超声裂解的菌液，离心分离上清液，进行蛋白的纯 化和洗脱操作，再进行10%的SDS-PAGE电泳鉴定，所制备得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO. 1所示的来自于池蝶蛘体内特有的LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO. 2所示的来自 于池蝶蛘体内特有的LITAF蛋白的氨基酸序列。
[0021] 挑选体重约1. 5kg的健康新西兰白雄兔进行免疫。经过一次初始免疫和两次加强 免