通过天然感受态转化属于链球菌属的细菌的方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2010年6月23日，题为"通过天然感受态转化属于链球菌属的 细菌的方法"的中国专利申请201080028500. 6的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及通过天然感受态（competence)转化属于链球菌属（Streptococcus genus)的细菌的方法。
【背景技术】
[0003] 嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus)广泛用于制造酸乳酪（yoghurt)和 瑞士型或意大利型干酪。这些产品具有每年大约四百亿美元的市场价值，从而使嗜热链球 菌成为具有巨大市场重要性的物种。即使该细菌的发酵性质已经通过筛选和传统方法得到 逐步改善，但仍然具有通过天然方法或通过遗传工程进一步改善的巨大潜能。为了能够不 使用任何遗传工程技术而天然改善嗜热链球菌技术性能、生理性质，在不同培养基中的行 为对于发酵食品和饲料业非常重要。所获得的嗜热链球菌改良株将完全顺从于与用于食品 和饲料的活微生物相关的当前所有的调节。
[0004] 当前可利用的嗜热链球菌基因组序列的计算机（insilico)分析提示，通过横向 基因转移获得许多基因（1)。如在使用感受态作为用于基因组可塑性的整体机制的病原性 链球菌中所报道的，这些横向基因转移潜在地通过被称为感受态的天然转化而发生。
[0005] 感受态是细胞从其环境中摄取细胞外（"裸")DNA并将该DNA(或其部分）整合在 其基因组中的能力。感受态可以分为天然感受态和人工感受态。天然感受态是细菌菌株在 遗传上具有执行该DNA摄取的特定能力。天然感受态被认为是在天然环境中自发发生，并 且还在实验室环境中观察到天然感受态。天然感受态似乎是链球菌的共同特征（2, 3)。与 之相比，人工感受态在实验室环境下激发并由使裸DNA能够瞬时透过细胞组成。
[0006] 因此，天然基因转化是通过天然感受态使给定细菌菌株能够被转化，即被修饰从 而将多核苷酸整合至其基因组的过程。
[0007] 在肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae)中对链球菌的天然感受态进行了最 深入的研宄，并且发现链球菌的天然感受态似乎是链球菌种的共同特征。感受态通常受到 严格调节并且包括两组基因：早期感受态基因和晚期感受态基因（4)。在肺炎链球菌中，天 然感受态是依赖于培养基中信息素（CSP)的积累的瞬时事件。早期感受态基因编码二组分 系统（TCS:ComD和ComE)，其同族诱导因子（CSP:ComC)和旨在CSP输出和熟化的ABC转运 子的组分（ComA和ComB)。CSP诱导时，TCS活化感受态〇因子ComX(〇X)的转录。该选 择性〇因子由于正调节DNA摄取、保护和整合至染色体所需的所有重要的晚期基因，而是 天然感受态的核心调节子。参见图1的图示。
[0008] 在嗜热链球菌（S.thermophilus)基因组中发现了推定的comX基因和组装对嗜 热链球菌天然感受态至关重要的所有晚期感受态基因的其他基因（1)。此外，计算机鉴定 中公认为 〇x的推定"ComX-盒"在含有至关重要的晚期感受态基因的所有操纵子的上游。 用于天然感受态的所有至关重要基因在嗜热链球菌中的这种维持提示其在嗜热链球菌生 态龛位中发挥重要的生理性功能（将DNA用作养分、基因组可塑性…）（1)。在2006年， Havarstein(5)小组通过使用遗传工程学方法发现天然感受态在嗜热链球菌LMG18311中 的功能性。这通过使用包含在调节肽诱导的启动子控制下的comX的基于质粒的系统而得 以实现（blp系统，（6))。显著地，利用全部基因组DNA或者线性dsDNA以与肺炎链球菌类 似的效率实现了高转化率（1(T3至1(T2) (5)。值得注意的是，在这种情况下，通过ComX的 遗传工程化诱导使晚期感受态基因的人工诱导成为可能。然而并且令人惊讶的是，通常发 现于肺炎链球菌基因组中并且在天然感受态的诱导中发挥关键作用的早期感受态基因无 一存在于嗜热链球菌基因组中。最近，证明嗜热链球菌LMD-9能够在在化学限定培养基中 生长的过程中诱导感受态。在LMD-9菌株中，发现在这些条件下尤其需要转运子Ami用于 comX的转录诱导（7)。Ami系统主动将细胞外培养基中存在的寡肽输入并已知在革兰氏阳 性菌中具有营养和信号转导的功能（7, 8, 9)。由于这种化学限定培养基是不含肽的培养基， Gardan等人（7)预言在这些生长条件下，细菌合成并分泌特定的感受态刺激肽，然后通过 Ami系统感受到该感受态刺激肽并再次输入。内化后，该现象然后与特定的胞质调节子相互 作用，导致comX的转录诱导（模型可参见图2)。在化学限定培养基条件下负责comX表达 和天然转化的信息素和转录调节子仍不可知。
[0009] 虽然化学限定培养基中的天然转化对于LMD-9菌株非常有效（10_4至10_3)， LMG18311菌株的转化率显著较低（1(T至1(T6)。此外，在化学限定培养基中生长的 CNRZ1066菌株的情况下，可能检测不到转化子（转化率< 1(T8) (7)。据发明人了解，目前没 有不使用遗传工程而在嗜热链球菌的菌株中诱导天然感受态的成功报道。
[0010] 现有技术仍然需要在链球菌中、优选嗜热链球菌和/或唾液链球菌 (Streptococcussalivarius)中诱导天然感受态的方法，和使用全世界公认的非GM0技术 转化所述细菌的方法。
【发明内容】
[0011] 本发明人已经鉴定了新的疏水短肽Shp316,其具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序 列，并且参与嗜热链球菌菌株的天然感受态。此外，本发明人还证明了该肽的片段能够在属 于链球菌属的细菌中诱导天然感受态。
[0012] Shp316具有以下氨基酸序列：
[0013] MKTLKIFVLFSLLIAILPYFAGCL(SEQIDN0:l)〇
[0014] 因此，本发明涉及具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列或与SEQIDNO: 1具有至 少75%的同一性的肽或者所述肽的片段，其中所述肽或其片段能够在嗜热链球菌菌株中诱 导或提高感受态。
[0015] 通常，所述肽或其片段能够在编码SEQIDNO: 1的基因已被失活的嗜热链球菌菌 株LMD-9中诱导或提高感受态。
[0016] 在本申请中，"本发明的肽"的表述涵盖具有氨基酸序列SEQIDNO: 1的肽、具有与 SEQIDN0:1具有某种相似性（至少75%的同一性）的氨基酸序列的肽和其片段（还称为 "成熟"肽）。本发明的肽的实例公开在附文III中。
[0017] 在提及肽时，"能够在编码SEQIDNO: 1的基因已被失活的嗜热链球菌菌株LMD-9 中诱导或提高感受态"的表述是指能够在实验A中将转化率提高至少10倍，优选至少50 倍，至少100倍，甚至更优选至少1000倍的任何肽。
[0018] 按照实施例中和以下的描述进行测定肽诱导或提高感受态的能力的实验A:
[0019] 将shp316基因（编码肽Shp316的基因）已失活的LMD-9的突变株，例如LMD9-A blp: :P_x-luxABAshp316: :P32-cat(该菌株的详细信息参见实施例2)在M17-乳糖培养基 中预培养。收集预培养的细胞（5000g，9分钟，20°C)并在化学限定培养基（CDM，参见附文 I)中洗涤2次，然后重悬在CDM中。将洗涤后的细胞稀释在新鲜的CDM培养基中以获得在 600nm为0.05的光密度，然后在37°C孵育。孵育1.5小时后，将培养基分为2份试样，每份 10mL，并将0或1000nM肽加入至所述培养样本中。最后，将10mL的每个试样分成两个样本， 每个样本5mL。所述2个样本之一接受1yg/mLpGIUD0855ery(具有红霉素抗性基因的质 粒）。通过进行实施例1所述的天然转化实验研宄样本的感受态表型。培养培养物6小时 并将系列稀释液铺在含有或不含2. 5yg/mL红霉素的M17-乳糖琼脂培养基的表面。针对 每个样本计算存在或不存在所述肽时的转化率，并用总细菌群中的红霉素抗性细胞的比例 表不。
[0020] 如果在所述肽存在下的转化率与不存在所述肽的转化率之比为至少10,优选至少 50,更优选至少100,甚至更优选至少1000,则认为所述肽已经诱导或提高了其中的shp316 基因已失活的LMD-9菌株的感受态。
[0021] 本发明的肽与SEQIDNO: 1可具有至少75%同一性，优选与SEQIDNO: 1具有至 少79%同一性，更优选与SEQIDNO: 1具有至少83%同一性，甚至更优选与SEQIDNO: 1 具有至少87%同一性，甚至更优选与SEQIDNO: 1具有至少91 %同一性，甚至更优选与SEQ IDNO: 1具有至少95%同一性。
[0022] 根据本发明的优选实施方式，本发明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列：AGCL或 TGCL〇
[0023] 根据本发明的优选的实施方式，本发明的肽的C-末端具有以下氨基酸序列： PYFAGCL、LPYFAGCL、ILPYFAGCL、AILPYFAGCL或PYFTGCL。
[0024] 在特定的实施方式中，所述多肽具有以下氨基酸序列： MKTLKIFVLFSLLIPILPYFAGCL(SEQIDN0:2)〇
[0025] 该序列与SEQIDNO: 1具有高于95%的同一性。推定该肽来自嗜热链球菌菌株 CNCM1-2423 的基因组，该菌株由RhodiaFoodSAS(B.P. 10,Z.A.deBuxi紅es, 86220Dan g6-Saint_Romain)于2000年4月5日保藏在法国微生物保藏中心（CNCM)(Collection NationaledeCulturesdeMicroorganismes, 28rueduDocteurRoux, 75724ParisCEDEX 15,France)，保藏号为CNCM1-2423。
[0026] 在另一个具体的实施方式中，所述肽具有以下氨基酸序列：
[0027] MKKLKLFTLFSLLITILPYFTGCL(SEQIDN0:3)〇
[0028] 该序列与SEQIDN0:1具有高于79 %的同一性，与SEQIDN0:1具有高于 83 %的相似性。推定该肽来自现有技术已知的菌株唾液链球菌菌株SK126 (登录号NZ_ ACL001000018)的基因组。
[0029] 因此，在具体的实施方式中，本发明的肽可以与SEQIDNO: 1具有至少79%相似 性，优选与SEQIDNO: 1具有至少83%相似性，更优选与SEQIDNO: 1具有至少87%相似 性，甚至更优选与SEQIDNO: 1具有至少91 %相似性，甚至更优选与SEQIDNO: 1具有至少 95 %相似性。
[0030] 通过使用基于化学相似性或氨基酸之间的进化距离的相似性打分矩阵测定两