Wdrpuh表位肽及包含它的疫苗的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 本申请是基于申请日为2009年12月3日，优先权日为2008年12月5日，申请 号为200980156195. 6,发明名称为："WDRPUH表位肽及包含它的疫苗"的专利申请的分案申 请。
技术领域
[0002] 本申请要求2008年12月5日提交的美国临时申请No. 61/200, 962和2009年3 月9日提交的61/209, 704的权益，通过述及将其全部内容收入本文。
[0003] 本发明涉及生物科学领域，更具体的说是癌症治疗领域。具体而言，本发明涉及作 为癌症疫苗极其有效的新肽，及用于治疗和预防肿瘤的药物。
[0004] 发明背景
[0005] 已经证明，⑶8阳性细胞毒性T淋巴细胞（CTL)可识别主要组织相容性复合物 (MHC)I类分子上出现的肿瘤相关抗原（TAA)衍生的表位肽，然后杀死肿瘤细胞。从TAA的 第一个例子一一黑素瘤抗原（MAGE)家族被发现起，人们主要通过免疫学手段（BoonT，Int JCancer1993May8,54(2) ： 177-80；BoonT&vanderBruggenP,JExpMed1996Mar 1，183(3) :725-9)已经发现了许多其它TAA。人们正在将这些TAA中的一些作为免疫治疗 的靶标进行临床开发。
[0006] 能够诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定保证了针对各种类型 癌症的肽疫苗接种策略的进一步开发和临床应用（HarrisCC，JNatlCancerInst1996 Oct16,88(20) ： 1442-55；ButterfieldLHetal. ,CancerRes1999Jul1,59(13)： 3134-42；VissersJLetal.,CancerRes1999Nov1,59(21) ：5554-9；vanderBurgSH etal.，JImmunol1996May1，156 (9) :3308_14;TanakaFetal.，CancerRes1997Oct 15,57(20) ：4465-8；FujieTetal. ,IntJCancer1999Jan18,80(2) ： 169-72；Kikuchi Metal.，IntJCancer1999May5,81(3) :459_66 ;0isoMetal.，IntJCancer1999 May5,81(3) :387-94)。到此为止，已经有数项使用这些肿瘤相关抗原衍生的肽进行临床试 验的报告。不幸的是，迄今为止在这些癌症疫苗试验中只观察到较低的客观应答率（Belli Fetal. ,JClinOncol20020ct15,20(20) ：4169-80；CouliePGetal. ,ImmunolRev 2002Oct，188:33-42;RosenbergSAetal.，NatMed2004Sep，10(9) :909_15)〇
[0007] 癌细胞增殖和存活不可缺少的TAA适合作为免疫疗法的靶标，因为使用此类TAA 可使广为记载的癌细胞的免疫逃避的风险最小化，癌细胞的免疫逃避可归于因治疗驱动的 免疫选择而发生的TAA删除、突变、或下调。
[0008] 通过使用含有23, 040种基因的全基因组cDNA微阵列的基因表达谱分析，WDRPUH 被鉴定为一种在肝细胞癌中上调的新型WD重复蛋白（Silvaetal.，Neoplasia2005 Apr;7(4):348-55,WO2003/104276)。已经报告含有WD重复的蛋白在广泛的生理功能中 发挥重要作用，包括信号转导、RNA加工（Bjornetal.，MolCellBiol. 1989S印；9(9): 3698-709)、细胞骨架的重塑（Vaismanetal.，MolGenGenet. 1995Apr20 ;247(2): 123-36)、对囊泡运输的调节（Pryeretal.，JCellBiol. 1993Feb; 120(4) :865-75)、和 细胞分裂（Feldmanetal.，Cell. 1997Octl7 ;91(2) :221_30)。Northern印迹分析显不，WDRPUH在绝大部分肝细胞癌中以显著高水平过表达，但是在除睾丸外的正常器官中则不表 达。此外，已经显示用siRNA遏制WDRPUH表达可显著抑制人肝细胞癌细胞系的生长（Silva etal. ,Neoplasia2005Apr；7(4) ：348-55,WO2003/104276) 〇 [0009] 引用表 [0010] 专利文献
[0011] [PTL1]W0 2003/104276
[0012] 专利文献
[0013] [NPL 1]BoonT，IntJCancer1993May8,54(2) : 177-80
[0014] [NPL 2]BoonT&vanderBruggenP,JExpMed1996Mar 1,183(3) ：725-9
[0015] [NPL 3]HarrisCC，JNatlCancerInst 19960ct16,88 (20) 1442-55
[0016][NPL 4]ButterfieldLHetal.，CancerRes1999Jull，59(13)，3134-42
[0017][NPL 5]VissersJLetal.，CancerRes 1999Nov1，59 (21) :5554_9
[0018] [NPL 6]vanderBurgSHetal. ,JImmunol1996May1,156(9) ：3308-14
[0019][NPL 7]TanakaFetal.，CancerRes19970ct15,57 (20) :4465_8
[0020] [NPL 8]FujieTetal. ，IntJCancer1999Jan18,80(2) :169-72
[0021] [NPL 9]KikuchiMetal. ,IntJCancer1999May5,81(3) ：459-66
[0022] [NPL 10]OisoMetal. ，IntJCancer1999May5,81(3) :387-94
[0023] [NPLll]BelliFetal.，JClinOncol20020ct15,20(20) :4169-80
[0024][NPL 12]CouliePGetal.，ImmunolRev20020ct，188 :33_42
[0025] [NPL 13]RosenbergSAetal.，NatMed2004S印，10(9) :909-15
[0026] [NPL14]Silvaetal.，Neoplasia2005Apr;7 (4) :348-55
[0027] [NPL15]Bjornetal.，MolCellBiol. 1989S印；9(9) :3698-709
[0028] [NPL16]Vaismanetal.，MolGenGenet. 1995Apr20 ;247 (2) : 123-36)
[0029] [NPL17]Pryeretal. ,JCellBiol. 1993Feb；120(4) ：865-75
[0030][NPL18]Feldmanetal.，Cell. 19970ct17 ;91(2) :221-30
[0031] 发明概述
[0032] 本发明部分基于合适的免疫疗法靶标的发现。由于TAA-般被免疫系统察觉为 "自身"并因此常常没有先天免疫原性，适宜靶标的发现是极其重要的。如上所述，在认识到 WDRPUH(由GenBank登录号NM_145054(SEQIDN0:63)的基因编码的SEQIDN0:64)已经 被鉴定为在肝细胞癌的癌症组织中上调后，WDRPUH成为免疫疗法的候选靶标。
[0033] 本发明至少部分基于WDRPUH的基因产物的拥有诱导对WDRPUH特异性的CTL的能 力的特定表位肽的鉴定。如下文详细讨论的，使用WDRPUH衍生的HLA-A*2402或HLA-A*0201 结合候选肽刺激从健康供体获得的外周血单个核细胞（PBMC)。然后建立了具有针对经每一 种候选肽冲激的HLA-A24或HLA-A2阳性靶细胞的特异性细胞毒性的的CTL系。结果证明， 所述肽是能诱导针对在表面上表达WDRPUH的细胞的强而特异性的免疫应答的HLA-A24或 HLA-A2限制表位肽。另外，它指明，WDRPUH具有强免疫原性，而且它的表位是肿瘤免疫疗法 的有效靶标。
[0034] 因而，本发明的一个目的是提供分离的与HLA抗原结合的肽，该肽由WDRPUH(SEQ IDN0:64)或WDRPUH的片段组成。此类肽预期具有CTL诱导能力且可用于离体诱导CTL或 用于给受试者施用以诱导抗癌症（诸如肝细胞癌）免疫应答。所述肽可以是九肽或十肽， 优选由选自SEQIDNO:1，2, 3,4,16,17, 30, 31，34, 36, 37,40,41，45,49, 55, 57 和 61 的氨基 酸序列组成，并显示强CTL诱导能力。
[0035] 此外，本发明涵盖经过修饰的肽，其具有氨基酸序列SEQIDNO:1，2,3,4，16，17， 30, 31，34, 36, 37,40,41，45,49, 55, 57和61，其中替代、插入、删除或添加了一个、两个或几 个氨基酸，只要经过修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。
[0036] 本发明的又一个目的是提供分离的编码任何本发明肽的多核苷酸。这些多核苷酸 可用于诱导具有CTL诱导能力的抗原表达细胞（APC)或用于给受试者施用以诱导针对本发 明肽，并因此最终针对癌症的免疫应答。
[0037] 当对受试者施用时，本发明的肽呈递在APC的表面上，然后诱导靶向相应肽的 CTL。因此，本发明的一个目的是提供含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂，用于诱导 CTL。这些含有任何本发明肽或多核苷酸的作用剂可用于治疗和/或预防癌症，诸如肝细胞 癌，和/或防止其术后复发。如此，本发明的又一个目的是提供用于治疗和/或预防癌症， 和/或防止其术后复发的药剂，其含有任何本发明肽或多核苷酸。本发明的制剂或药剂也 可含有呈递任何本发明肽的APC或外来体作为活性组分，作为本发明的肽或多核苷酸的替 代或补充。
[0038] 本发明的肽或多核苷酸具有诱导APC的能力，所述APC在其表面上呈递HLA抗原 与本发明肽的复合物。例如，诱导可通过使受试者衍生的APC与本发明的肽接触或向APC 中导入编码本发明肽的多核苷酸来实现。此类APC具有针对靶肽的高CTL诱导能力，而且 可用于癌症免疫疗法。因此，本发明的又一个目的是提供用于诱导具有CTL诱导能力的APC 的方法和通过该方法获得的APC。
[0039] 本发明的又一个目的是提供用于诱导CTL的方法，该方法包括共培养⑶8阳性细 胞与在其表面上呈递本发明肽的APC或外来体的步骤或向T细胞中导入多核苷酸的步骤， 该多核苷酸编码与本发明肽结合的T细胞受体（TCR)亚单位多肽。通过该方法获得的CTL 可用于治疗和/或预防癌症，诸如肝细胞癌。因此，本发明的又一个目的是提供通过任何本 发明方法获得的CTL。
[0040] 本发明的另一个目的是提供用于诱导抗癌症免疫应答的方法，该方法包括施用含 有任何本发明WDRPUH多肽、编码WDRPUH多肽的多核苷酸、呈递WDRPUH多肽的外来体或APC 的制剂的步骤。
[0041] 本发明可用于任何涉及WDRPUH过表达的疾病，包括但不限于癌症，特别是肝细胞 癌。
[0042] 要理解，上面的发明概述和下面的详细描述都是例示性的实施方案，而非限制本 发明或本发明的其它备选实施方案。
[0043] 本发明还包括以下内容：
[0044] 项1. 一种分离的结合HLA抗原且具有细胞毒性T淋巴细胞（CTL)诱导能力的肽， 其中该肽由氨基酸序列SEQIDNO:64组成或为其片段。
[0045] 项2.项1的分离的肽，其中所述HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2。
[0046] 项3.项1或2的分离的肽，其是九肽或十肽。
[0047] 项4?项1至3任一项的分离的肽，其包含选自SEQID N0:2，l，3,4，16，17,30,31， 34,36,37,40,41，45,49,55,57 和61的氨基酸序列。
[0048]项 5?项 4 的分离的肽，其由选自SEQIDNO:2，1，3,4，16，17,30,31，34,36,37,40， 41，45,49, 55, 57和61的氨基酸序列组成，其中替代、删除、插入和/或添加了 1个、2个或 几个氨基酸。
[0049] 项6.项5的肽，其由选自SEQIDNO:1，2,3,4，16和17的氨基酸序列组成，其中 当所述HLA抗原是HLA-A24时，所述肽具有下面的一项或两项特征：
[0050] (a)N端起的第二个氨基酸选自苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，和
[0051] (b)C端氨基酸选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
[0052]项 7?项 5 的肽，其由选自SEQIDNO:30,31，34,36,37,40,41，45,49,55,57 和 61的氨基酸序列组成，其中当所述HLA抗原是HLA-A2时，所述肽具有下面的一项或两项特 征：
[0053] (a)N端起的第二个氨基酸选自亮氨酸和甲硫氨酸，和
[0054] (b)C端氨基酸选自缬氨酸和亮氨酸。
[0055] 项8. -种分离的多核苷酸，其编码项1至7任一项的肽。
[0056] 项9. 一种用于诱导CTL的作用剂，其中所述作用剂含有一种或多种项1至7任一 项的肽或者一种或多种项8的多核苷酸。
[0057] 项10. -种用于治疗和/或预防癌症和/或防止其手术后复发的药剂，其中所述 药剂包含一种或多种项1至7任一项的肽或者一种或多种项8的多核苷酸。
[0058] 项11.项10的药剂，其配制为供施用给其HLA抗原为HLA-A24或HLA-A02的受试 者。
[0059] 项12. -种诱导具有CTL诱导能力的抗原呈递细胞（APC)的方法，其中所述方法 包括选自如下的步骤：
[0060] (a)在体外、离体或在体内使APC与项1至7任一项的肽接触；和
[0061] (b)将编码项1至7任一项的肽的多核苷酸导入APC。
[0062] 项13.-种用于诱导CTL的方法，其中所述方法包括选自如下的步骤：
[0063] (a)共培养⑶8阳性T细胞与APC，所述APC在其表面上呈递HLA抗原与项1至7 任一项的肽的复合物；
[0064] (b)共培养CD8阳性T细胞与外来体，所述外来体在其表面上呈递HLA抗原与项1 至7任一项的肽的复合物；和
[0065] (c)向T细胞中导入编码与项1至7任一项的肽结合的T细胞受体（TCR)亚单位 多肽的多核苷酸。
[0066] 项14. 一种分离的APC，其在其表面上呈递HLA抗原与项1至7任一项的肽的复合 物。
[0067] 项15.项14的APC，其是通过项12的方法被诱导的。
[0068] 项16. -种分离的CTL，其靶向项1至7任一项的任何肽。
[0069] 项17.项16的CTL，其是通过项13的方法被诱导的。
[0070] 项18. -种诱导受试者中抗癌症免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者施 用包含项1至7任一项的肽、其免疫学活性片段、或编码所述肽或所述片段的多核苷酸的作 用剂的步骤。
[0071] 附图简述
[0072] 在考虑本发明的附图简述和后面的详细描述及优选实施方案后，本发明的各方面 和应用对于熟练技术人员会变得显而易见。
[0073] 图la-f包括一系列照片，描绘用WDRPUH衍生肽诱导的CTL的IFN-yELISPOT 测定的结果。用WDRPUH-A24-9-40(SEQIDNO:1)刺激的3号和6号孔（