一种用于检测乙型肝炎病毒cccDNA的定性和绝对定量试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种有效检测乙型肝炎病毒DNA以及乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的定性试剂盒和绝对定量试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002]聚合酶链反应技术(polymerase chain react1n，简称PCR)又称体外酶促基因扩增。由Mullis发明于1983年，它以敏感，特异，快速的核酸分析技术而著称，是分子生物学技术的一项突破。其基本原理为，模拟于DNA的自然复制过程，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA多聚酶的作用下，按照碱基配对的原则(A、T，C、G)，从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性，退火，延伸等一次循环，DNA链数量增加一倍。传统的PCR是基于琼脂糖凝胶电泳的方法对扩增产物进行终点分析的一种半定量、定性方法，其主要的优点是简便易行，而且成本低廉。在PCR定量技术中，常用的实时荧光定量PCR是通过反应过程中荧光信号的累积来反应产物的量，但是荧光定量PCR需要标准品做参照，只是一种相对定量的方法，而且扩增效率的改变也会影响荧光定量PCR的结果。而数字PCR即Digital PCR,它是一种核酸分子绝对定量技术，能够高敏感的对目的DNA进行精确定量。数字PCR可让你能够直接数出目的DNA分子的拷贝数。数字PCR是建立于传统的PCR和荧光探针的使用基础之上，且不需要建立标准曲线，也不需要标准品做参照就能够高灵敏的对核苷酸进行绝对定量。其主要原理是将一个PCR体系分散成20000个油包水的微滴，通过普通PCR的扩增后，具有荧光信号的微滴视为阳性，不具有荧光信号的微滴视为阴性，再通过泊松分布对阳性微滴和阴性微滴进行统计学分析从而对检测样品中目的DNA分子进行绝对精确定量。
[0003]乙型肝炎病毒严重危害人类健康，在人体内其主要的复制/生活过程为:乙型肝炎病毒(HBV)与肝表面受体结合，胞质内脱病毒衣壳，其松弛的不完全闭合的环状DNA(rcDNA)进入细胞核，在宿主和病毒DNA聚合酶作用下，以负链DNA为模板，延长修补DNA裂隙区，完成正链两端连接而形成双链完整的cccDNA，cccDNA转录形成4种病毒mRNA，mRNA翻译形成病毒蛋白并逆转录形成单链DNA，再以负链DNA作为模板，通过病毒DNA聚合酶的作用，合成正链DNA，与负链DNA—起组成新的rcDNA。后者再通过病毒表面蛋白(衣壳蛋白)包装形成具备感染能力的病毒颗粒并释放到细胞外。
[0004]可见cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5?50个拷贝，但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，现有的核苷类似物抗病毒药物并不能有效的清除cccDNA，体内一旦存在cccDNA，HBV就有可能再次复制，导致乙肝复发。因此其是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。由于细胞内cccDNA含量较少，检测上相对困难。
[0005]国内外对于cccDNA定量检测的方法有很多，基本上都是利用cccDNA两条链均是完整的，而rcDNA存在缺口这个区别，通过荧光定量PCR来实现。
[0006]1、巢式聚合酶链反应也称套式PCR。
[0007]由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应，第一对引物跨越环状HBV-DNA的DRU DR2重复序列旁的两个缺刻，第二次PCR以一次PCR产物为模板扩增rcDNA缺口内部区域。其引物设计的原理也是基于cccDNA与rcDNA结构的不同，因此，cccDNA能够被扩增，而rcDNA则不能扩增。董庆鸣等[董庆鸣，魏红山，庄辉，等.套式聚合酶链反应法(nPCR)检测血清中HBV cccDNA[J].中国医学检验杂志，2005，6 (3): 168-170.]用该法检测HBV cccDNA标准对照质粒，结果表明该法可以检测到5 X 15拷贝/L HBVcccDNA，但是两步法在取样时容易产生误差，且容易产生污染，并且耗时较长，较繁琐。
[0008]2、嵌合引物两步法荧光定量PCR。
[0009]Shao 等[SHAO JB, CHEN Z, NI WQ, et al.A quantitative method to detect HBVcccDNA by chimeric primer and real-time polymerase chain react1n[J].J VirolMethods, 2003, 112(1-2):45-52.]根据非cccDNA形式的HBV基因组存在缺口，设计由两段序列构成的嵌合引物。其3'端的12个碱基与正链(1604?1615)互补，结合位点为负链缺口上游DR2缺口下游，5'端的一段与人类免疫缺陷病毒的部分基因序列一致而与HBV基因组无同源性。首先用该嵌和引物对模板DNA进行15个循环的单链延伸，在该反应过程中，cccDNA因为正链完整，引物能够顺利延伸形成一条新生链；而HBV DNA的其他形式，如rcDNA,由于DR2区存在缺口，引物的延伸停止于DR2区，不能产生单链延伸产物。新生链形成以后，设计另一对引物，一个与嵌合性引物的片段B杂交，另一个与正链DR2后的序列互补，这样可以保证只能检测单链延伸反应的产物而不能直接检测HBV基因。此方法检测肝组织样本阳性结果为15-1O6拷贝/ml。但存在的问题是第一轮扩增产物如果不经过纯化直接充当模板，则会因为成分复杂而直接影响第二轮扩增的效率，如果纯化则会影响准确性。
[0010]3、入侵检查
[0011]针对目标DNA设计两种探针，一种称为初始探针，另一种称为入侵探针，初始探针的5端有I段寡核苷酸序列不与目标DNA互补，入侵探针的3端的单个碱基不与目标DNA互补，flap核酸内切酶I将初始探针5端不与目标DNA互补的那段寡核苷酸序列剪切下来，此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭基团的荧光共振能量转移探针结合，从而产生荧光信号。Wong等6根据此原理，设计了与正链上游、负链下游HBV直接重复序列2区结合的入侵探针，由于cccDNA正链、负链均完整，故产生2种荧光信号，但rc DNA正链含有缺口，故只能产生I种荧光信号，可根据DNA产生的荧光信号区分cCCDNA、rCDNA。此方法虽然特异性较高，但反应体系成分较复杂，反应效率难以控制。所需时间较长，除了变性、热启动处理还需在64°C条件下循环反应240min。
[0012]4、Light Cycler?实时定量 PCR 方法。
[0013]Singh 等[Singh M, Dicaire A, Wakil AE, Luscombe C，Sacks SK.Quantitat1nof hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA)in the liverof HBV-1nfected patients by LightCycler real-time PCR.J Virol Methods 2004 ；118:159-167.]研宄的利用Light Cycler?实时定量PCR仪检测HBV感染患者肝脏组织中cccDNA的方法。其引物设计是跨越了 rcDNA的空隙区，并且采用双探针体系。其特点是为了消除rcDNA非特异性扩增对结果的干扰，除了设计特异性引物和探针外，还应用了 Plasmid-Safe?ATP-Dependent DNase 降解 rcDNA。该方法特异性较好，使用了 LightCycler?实时定量PCR检测体系，检测结果相对稳定可靠，其敏感性为10 1拷贝/mg。但是该方法的探针合成、仪器设备及耗材成本均较高，限制临床应用。
[0014]5、实时定量PCR检测方法
[0015]He 等[He ML, Wu J, Chen Y, Lin MC, Lau GK, Kung HF.A new and sensitivemethod for the quantificat1n of HBV cccDNA by real-time PCR.B1chem B1physRes Commun 2002 ;295:1102-1107.]根据cccDNA与rcDNA在结构和生化特性上的不同，建立了实时荧光定量PCR扩增法。他们将具有发光基团和淬灭基团的TaqMan探针设计于负链缺口的下游，与负链互补。在上游引物的引导下，若负链是完整的，Taq酶则到达Taq-Man探针所结合的位点，利用其5' —3'的外切酶活性将探针切断，从而3'端的淬灭基团失去对5'端发光基团的抑制作用，产生荧光信号。相反，若负链含有缺口，由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口，故不能产生荧光信号。这样，cccDNA和rcDNA得以区分开来。其定量检测的线性范围是I X 12?I X 10 7拷贝/L。该方法对比分析了 HBV基因库中150条已知A-G基因亚型的序列，根据保守区域设计引物，能检测A、B、C、F、G基因型，故该方法可用于90%亚太地区的乙肝病人cccDNA的检测。目前认为该法是临床肝穿刺标本中cccDNA定量的金标准，但此方法特异性较低。
[0016]目前，有专利中提及的cccDNA的检测方法是基于HE等发明的实时定量PCR检测方法，此方法是针对HBV负链缺口设计的引物探针进行荧光定量PCR检测cccDNA，但在此方法情况下，也会产生rcDNA产物，特异性较差且荧光定量PCR技术去标准品作为参照，只是一个相对定量技术，并不能够进行绝对定量，灵敏度也相对较低。且目前对cccDNA进行定性