基于高分辨透射电子显微学的单分子dna测序方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法。
【背景技术】
[0002]2002年，通过六个国家超过十年的合作研宄，人类获得了第一组人类遗传物质一一DNA序列图谱，这宣布了人类正式迈向后基因组时代。人类自身DNA序列图谱的测定，对于健康预测、疾病诊断、个体化医疗等领域具有其余技术不可替代的作用，即将对人类的生存和繁衍产生愈来愈广泛和深远的影响。
[0003]到2014年为止，DNA序列检测技术(简称测序)的发展历程大致可以分为三代。第一代测序技术基于Sanger化学终止法和大规模克隆技术，其优点是准确率高，但其效率极其低下、成本巨大；第二代测序技术基于鸟枪片段化法、短序列拼接的生物信息学技术，其优点是效率显著提高，成本也下降了几个数量级，但因其仍然需要大规模的DNA复制，成本非普通人可以负担，而且短序列的拼接准确率不够高，因此第二代测序技术仍然无法满足让每个人类个体都拥有自己DNA序列数据的需求。第三代测序技术，又称单分子测序技术，以纳米孔测序技术为代表。其特点是，彻底放弃DNA复制的过程，实现单拷贝DNA序列直接读取，因此理论上在速度和成本方面都可以满足个体DNA测序的需求。然而，第三代测序技术难度极高，发展至今遇到了理论和实验上的诸多瓶颈。例如，DNA过孔速度为随机过程，无法控制纳米孔的俘获率和过孔速度，造成了无法识别单碱基携带的信息；此外，纳米孔的制备过程成本仍然极高、费时、至今尚不具备规模化生产条件。目前为止，还没有仅仅使用第三代技术完成过人类基因组的测序的相关报道。
[0004]由此可见，基因测序发展的关键，在于节省成本、提高效率。而实现这一目的的技术途径，是必须放弃大规模扩增的方法。换言之，只有单分子(单拷贝)的测序技术，才是真正能够实现低成本、普及化的人类个性化测序技术。但虽然历经二十余年发展，基因测序技术目前仍无法走进普通人的生活，原因也就在于单分子测序技术还没有突破其技术瓶颈，走向实用。因此，我们亟需在前人的基础上发展一种相对简易可行，成本适中的单分子测序方法。
[0005]透射电子显微技术(TEM)是以高压加速电子作为成像源，对纳米尺度的样品进行高分辨成像和成分分析的技术。TEM发展至今，其信息分辨率普遍已经优于0.24纳米，小于DNA相邻碱基之间的距离(0.34nm)。装备有球差(Cs)校正装置的TEM，分辨率更可以达到0.05-0.08nm，足以对单原子进行成像。随着Cs-TEM技术的不断完善和成本的持续降低，我们有理由相信，基于单原子标记的超高分辨TEM的单分子DNA直读测序技术将成为一种简单可行、成本适中的单分子测序技术。
[0006]单个原子标记是一种湿法化学标记法。标记物三个维度的尺寸都在I纳米以下，仅有单个或数个原子构成，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应(quantum confinement effect)特别显著。由于单原子尺寸小，单分散性好，尤其适合进行DNA等生物样品标记，由于重金属化学元素的原子序数和晶体结构都具有明显差异，在超高分辨透射电镜之中易于以衍射衬度、Z-衬度的成像模式予以分辨，因此单原子标记方法特别适合用于DNA序列在高分辨TEM中的标记成像。
【发明内容】
[0007]发明目的:针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供了一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，使用不同的重元素单原子对单链DNA进行单原子标记；再发展透射电子显微镜(TEM)技术，对标记物-DNA复合物进行高分辨成像，实现DNA序列在TEM中的直接可读化。
[0008]技术方案:为实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案是:一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，所述测序方法是通过使用重元素标记物的单个原子或少量原子对核酸单拷贝序列进行标记，并采用高分辨透射电子显微镜进行成像和结果分析。
[0009]其中，上述核酸单拷贝是指直接从生物细胞或组织中分离纯化所得的核酸产物；核酸单拷贝制备方法请见F.M.奥斯伯等主编《精编分子生物学实验指南(第四版)》科学出版社2005年第一版。
[0010]其中，上述重元素标记物为金、银、铂、钨、汞、铅、铀或具有高原子序数的常见金属及其无机或有机化合物、复合物、螯合物。
[0011]其中，上述重元素标记物的三维特征尺寸小于I纳米，即仅由单原子或数个原子组成，并能够与不同类型的碱基进行特异性结合。
[0012]其中，上述测序方法通过使用高分辨透射电子显微镜的明场、暗场、扫描透射法、高角环形暗场、电子特征X射线能谱、电子能量损失谱、能量过滤成像技术中的一种或两种以上技术的组合体进行成像分析。
[0013]上述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，具体包括以下步骤:
[0014]I)单原子标记物溶液的准备:准备3种或3种以上具有不同原子序数的重金属盐溶液；将其稀释后分别与不同的dNTP或其单体的寡聚物溶液反应，得到单原子标记物溶液；
[0015]2)待测DNA的寡核苷酸杂交标记:将待测双链DNA的解链后与步骤I)的单原子标记物溶液混合反应，即得到标记DNA样品溶液；
[0016]3) TEM样品制备:取步骤2)得到的DNA样品溶液制备于电镜载网上，得到用于TEM观察的电镜样品；
[0017]4) TEM成像:取电镜样品TEM成像即可得到待测DNA片段的序列信息。
[0018]所述重金属盐溶液可包括但不限于硝酸银溶液、高氯酸金溶液、醋酸铀溶液、氯酸铬溶液、醋酸铅溶液、氯化汞溶液、氯化钡溶液和四氧化锇溶液中的3种或3种以上的溶液。
[0019]所述TEM观察的电镜样品的制备方法为:取步骤2)的DNA样品溶液滴于电镜专用铜网上，热风快速干燥或者用50°C以下低温烘烤法得到用于TEM观察的电镜样品。
[0020]所述TEM成像模式为将电镜样品在透射电镜下成高分辨明场像直接观察，或以高分辨STEM模式高角环形暗场检测器进行暗场成像；或先成明场像再使用特征X谱图的方式对关注的区域进行特征元素谱图成像；或先成明场像再使用电子能量损失谱谱图的方式对关注的区域进行特征元素谱图成像。
[0021]具体的测序方法如下:
[0022]1.单原子标记物溶液的的准备
[0023]101.单原子标记物应为具有不同原子序数的重金属盐溶液。可以将金属盐分散于有机相、水相中，要求为纯度高(色谱纯以上)，新鲜制备，至少需准备3种具有不同原子序数的重金属盐溶液，如硝酸银、高氯酸金、醋酸铀、氯酸铬等，但不局限于此四种盐溶液。
[0024]102.DNA寡核苷酸的修饰:将上述四种盐溶液用0.2M磷酸盐缓冲液(pH = 7.4)稀释至0.lmmol/L，4种dNTP (dA、dT、dC、dG)或其单体的寡聚物溶液稀释至0.2mmol/L (相对于标记物过量)。4种标记物分别与4种dNTP等体积混合，25摄氏度条件下反应2小时；15000转/分钟离心30分钟后弃去上清液，用磷酸盐缓冲液重新分散标记物-寡核苷酸沉淀至0.lmmol/L浓度。
[0025]2.待测DNA的寡核苷酸杂交标记
[0026]201.待测DNA的磷酸盐缓冲液置于95摄氏度水浴中，保持30分钟后取出，立即置于冰水混合物中I分钟(解链)；
[0027]202.待测DNA溶液逐次与修饰过的四种标记寡核苷酸混合，保持冰水混合物温度下反应30分钟后，4000转/分钟离心7分钟，取上清液；
[0028]203.在冰水混合物温度条件下反复201操作3次；保留上清液；
[0029]3.TEM样品制备
[0030]301.取步骤203得到的上清液10_20微升，滴在1000-2000目的电镜专用铜网上，热风或50摄氏度以下低温烘烤法快速干燥，得到适用于TEM观察的样品；
[0031]4.TEM 成像
[0032]401.取步骤301得到的电镜样品，在透射电镜下以高分辨TEM模式或STEM高角环形暗场(HAADF)模式进行成像，应能够观察到4种不同的原子衬度，分别代表不同的碱基(A/T/C/G中的一种)。将碱基信息顺序记录，即得到待测基因片段的序列信息。
[0033]有益效果:与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0034]1.与完成人类基因组测序使用的Sanger末端终止法相比，本发明无需进行大规模的DNA细胞克隆(体内扩增)，时间和成本均下降6个数量级以上；
[0035]2.与目前广泛使用的第二代测序技术，如454、焦磷酸测序、鸟枪法等技术相比，本发明无需进行聚合酶链式反应(PCR)进行体外扩增，而仅需单分子DNA拷贝即可直接读取序列，时间和成本均下降3个数量级以上；也省略了将DNA片段打碎成为20-100bp的短碱基序列再拼接的步骤，一次性读长可提高100倍以上，并且无需后续大规模拼接，所需时间下降两个数量级以上，序列信息准确率从90%左右提高到99%以上；
[0036]3.与目前正在开发的，以纳米孔测序为代表的