利用木材水解液制备微生物油脂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种利用木材水解液制备微生物油脂的方法。
【背景技术】
[0002]传统的能源物质煤、石油及天然气的大量消耗使得寻找可替代的再生能源日益紧迫。生物质能是太阳能以化学能形式贮存在生物质中的能量形式，在整个能源系统中占有重要地位，它直接或间接地来源于绿色植物的光合作用，是一种可再生的绿色能源。木质生物质能是生物质能的重要组成部分。中国陆地林木生物质资源总量在180亿吨以上，但长期以来直接燃烧一直是我国对木质生物质能源的主要利用方式。近年来，木质生物质能源的研宄和应用有了快速发展，不仅可应用于制浆造纸工业，也可替代有限的石化资源用于生产化学品、合成材料和再生能源等。然而，木质生物质结构复杂，纤维素，半纤维素与木质素紧密结合，相互缠绕，严重制约了其转化效率。预处理技术作为生物质精炼高效转化的关键步骤，已成为世界各国的研宄热点。其中，热水预处理是分离半纤维素的一种有效方法，木质生物质以水作为反应介质，高温高压下半纤维素中的乙酰化聚糖释放出乙酸，导致半纤维素聚糖溶出，聚糖可不同程度分解为葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖等。已有研宄者将水解液中的半纤维素衍生糖类进行微生物发酵制取乙醇等化学物质。
[0003]生物柴油是一种可再生的油脂原料，由动物脂肪，植物油脂和微藻，通过其与醇类(如甲醇)在催化剂作用下合成的长链脂肪酸甲酯类物质。然而，生物柴油制备过程受油料供给成本制约，难以满足日益扩大的市场需求。采用廉价原料降低成本，是生物柴油能否实用化的关键。因此，开发新型的油脂生产方式成为未来重要的发展方向之一。近年来，来自于产油微生物的单细胞油脂(SCOs)作为生物柴油油脂原料的来源已经收到广泛关注。利用微生物油脂生产生物柴油具有微生物生长周期短，产量高及油脂成分与植物油相似等优点。目前，液态发酵是微生物油脂的主要工业生产方式，其碳源主要来自于粮食作物。这种方法生产成本高昂，已成为微生物油脂发展的阻碍之一。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有微生物油脂生产碳源原料成本过高的技术问题，提供一种价格低廉的原料用于可应用于生物柴油的微生物油脂的生产。
[0005]为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下:
提供一种用木材水解液制备微生物油脂的方法，包括以下步骤:
51、将木材进行热水处理得到木材水解液；
52、将所述木材水解液去毒，在去毒后的木材水解液中添加盐分，调节pH值为7?9，灭菌，制备成培养基；
53、在所述培养基中接入产油脂菌的种子液，发酵得到发酵液；
54、取所述发酵液中的菌体进行油脂交换反应得到微生物油脂。
[0006]上述的方法，优选的，步骤S3中发酵时间为32?56 h。
[0007]上述的方法，优选的，所述SI步骤中所述热水处理步骤具体为:将木材与水按照固液比为1: 5?8混合，在150?200°C条件下反应30?120 min。
[0008]上述的方法，优选的，所述S2步骤中所述去毒步骤包括以下步骤:
S2-1、石灰法:在所述木材水解液中添加Ca (OH)2,使pH为10?12，I h过滤取滤液，得到碱性木材水解液；在所述碱性木材水解液中加入H2SO4调节pH为5?6，I h过滤取滤液，得到酸性木材水解液；在所述酸性木材水解液中加入Na2SO3,在100°C反应10?20 min,过滤得到滤液。
[0009]S2-2、吸附法:在所述步骤S2-1制备得到的滤液中添加吸附树脂，进行震荡吸附8?12 h，完成去毒步骤。上述的方法，优选的，所述S2-2步骤中，所述吸附树脂为Amberlite XAD-4，所述吸附树脂与所述滤液的质量体积比为1: 4?6 ;所述震荡吸附反应的温度为25?35°C，转速为100?160 rpm。
[0010]上述的方法，优选的，所述盐分包括0.5?I g/L的(NH4) 2S04、0.5?1.5 g/L的MgSO4.7Η20、0.010 ?0.015 g/L 的 CaCl2.2Η20、0.5 ?1.5 ml/L 的微量元素液、0.5 ?1.5ml/L的Stock A溶液和30?40 ml/L的磷酸盐缓冲液。
[0011]上述的方法，优选的，所述微量元素液包括0.3?0.6 g/L的FeSO4.7H20、0.3?0.5 g/L 的ZnSO4.7Η20、0.01 ?0.02 g/L 的MnSO4.Η20、0.010 ?0.020 g/L 的H3BO3、0.005 ?0.015 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 ?0.25 g/L 的 EDTA、0.04 ?0.06 g/L 的 CoCl2.6H20、0.004 ?0.006 g/L 的 CuCl2.2Η20 ;所述 Stock A 溶液包括 1.5 ?2.5 g/L 的 NaMoO4.2Η20及4.0?5.0 g/L的乙二胺四乙酸铁钠；所述磷酸盐缓冲液包括110?115 g/L的Κ2ΗΡ04、45 ?48 g/L 的 ΚΗ2Ρ04。
[0012]上述的方法，优选的，所述产油脂菌为浑池红球菌(/Sot/ococciAs opacus)。
[0013]上述的方法，优选的，所述木材包括针叶材(如松木)和阔叶材(如楓香木)。
[0014]上述的方法，优选的，所述酯交换反应为:将菌体、有机溶剂和催化剂混合，萃取收集有机相，得到所述微生物油脂。
[0015]上述的方法，优选的，所述有机溶剂为氯仿和甲醇混合溶液，所述催化剂为浓硫酸；所述菌体、氯仿、甲醇的质量体积比为10 mg: 2?5 mL:1?4.5 mL。
[0016]与现有技术相比，本发明的优点在于:
(I)本发明采用了木质生物质为原料，将其通过热水处理制备水解液，将水解液通过微生物发酵的方法转化为微生物油脂并作为生物柴油应用的油脂原料，不仅为微生物油脂生产提供了一种经济的原料来源，同时拓展了木质生物质热水预处理水解液利用的新途径，操作简单，成本低廉。
[0017](2)本发明采用浑浊红球菌作为发酵菌种，易培养，生产周期短，产油量较高，油脂分布随着木质纤维素原材料种类及生长条件不同而变化，在一定程度上可调控生产具有一定特性的微生物油脂。
[0018](3)我国林木资源丰富，本发明采用木材作为热水预处理原料(包括针叶材和阔叶材)，进一步发展了中国林木生物质能源的应用潜力。
【附图说明】
[0019]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0020]图1为实施例1中浑浊红球菌PD630在松木水解液中的细菌生长及油脂积累随时间的变化示意图。
[0021]图2为实施例2中浑浊红球菌DSM 1069在松木水解液中的细菌生长及油脂积累随时间的变化示意图。
[0022]图3为实施例3中浑浊红球菌PD630在楓香木水解液中的细菌生长及油脂积累随时间的变化情况示意图。
【具体实施方式】
[0023]以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0024]以下实施例中Amberlite XAD-4购于Sigma-Aldrich, USA ;产油脂菌为浑池红球HRhodococcus菌株编号为 DSM 44193 (PD 630)或 DSM 1069，均购于德国微生物菌种保藏中心，网址为WWW.dsmz.de。
[0025]实施例1
本发明利用木材水解液制备微生物油脂的方法，采用木材为针叶材，具体为松木材；采用的产油脂菌为浑池红球菌(热ot/ococciAs opacus) PD 630，菌株编号为DSM 44193。
[0026]具体包括以下步骤:
Cl)热水处理:将松木切片，粉碎得到松木材粉末。称取10g的松木材粉末，加入800ml去离子水，混合均匀，放入反应釜中，以180°C温度下反应I h (在150?200°C条件下反应30?120 min也可实施)，取出过滤，收集滤液得到木材水解液。
[0027](2)去毒:
2.1、在步骤(I)中制备得到的木材水解液中添加Ca (OH) 2，使pH为10，I h后将水解液过滤取滤液得到碱性木材水解液；在碱性木材水解液中加入2 M的H2SO4,调节pH为5.5，I h后再次过滤取滤液，得到酸性木材水解液；在木材水解液中加入0.1 g/L Na2SO3, 100C下反应15 min，然后冷却至室温，过滤取滤液。
[0028]2.2、在步骤2.1制备得到的滤液中按照固液比为Ig: 4ml添加吸附树脂Amberlite XAD-4得到混合液，将混合液置于30°C，160 rpm条件下震荡8 h，再次过滤得到去毒后的木材水解液。
[0029](3)配制培养基:在去毒后的木材水解液中添加盐分，调节pH值为7.5 (pH为7?9均可实施)，灭菌，制备成培养基。
[0030]步骤(3)中，盐分具体为0.5 g/L 的(NH4)2SCV0.5 g/L 的 MgSO4.7H20、0.010 g/L的CaCl2.2Η20、0.5 ml/L的微量元素液、0.5 ml/L的Stock A溶液和30 ml/L的磷酸盐缓冲液。
[0031]其中微量元素液包括0.3 g/L 的 FeSO4.7H20、0.3 g/L 的 ZnSO4.7Η20、0.01 g/L的 MnSO4.Η20、0.010 g/L 的 H3BO3、0.005 g/L 的 NiCl2.6Η20、0.20 g/L 的 EDTA、0.04 g/L的 CoCl2.6Η20、0.004 g/L 的 CuCl2.2H20。
[0032]Stock A溶液包括1.5 g/L的NaMoO4.2H20及4.0 g/L的乙二胺四乙酸铁钠。
[0033]磷酸盐缓冲液包括110 g/L 的 K2HP04、45 g/L 的 ΚΗ2Ρ04。
[0034](4)发酵:在步骤(3)制备得到的培养基中按照体积百分含量添加1%的PD630种子液，在30°C，150 rpm条件下震荡培养72 h得到发酵液(震荡吸附反应的温度为25?35°C，转速为100?160 rpm均可实施)。
[0035](5)油脂交换反应:定时取样收集发酵液中的菌体3.3mg，加入Iml氯仿，0.85 ml甲醇，0.15 ml浓硫酸反应萃取后收集有机相，得到微生物油脂。
[0036]将实施例1中制备得到的微生物油脂进行气相色谱-质谱联用仪的分析，分析结果参见图1。由图1可知，48 h可得到最大产油量，为0.21 g/L，细菌油脂含量为24.8%。
[0037]实施例2
本发明利用木材水解液制备微生物油脂的方法，采用木材为针叶材，具体为松木；采用的产油脂菌为浑池红球菌(TPAot/ococciAs菌株编号为DSM 1069。
[0038](I)热水处理:将松木切片，粉碎得到松木材粉末。称取150g的松木材粉末，加入800 ml去离子水，混合均匀，放入反应釜中，以200 °C温度下反应I h (在150?200°C条件下反应30?120 min也可实施)，取出过滤，收集滤液得到木材水解液。
[0039](2)去毒:
2.1、在步骤(I)中制备得到的木材水解液中添加Ca (OH) 2,使pH为11，I h后将水解液过滤取滤液得到碱性木材水解液；在碱性木材水解液中加入2 M的H2SO4,调节pH为5，Ih后再次过滤取滤液，得到酸性木材水解液；在木材水解液中加入0.1 g/L Na