一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方 法。该方法通过对MitTx蛋白编码序列进行优化，利用大肠杆菌进行重组表达，表达的蛋白 经过复性纯化得到具有生物学活性的重组蛋白。
【背景技术】
[0002] MitTx是Bohlen于2011年从德克萨斯州珊瑚蛇毒液中分离得到，由a和目亚基 组成，该2个亚基可1:1的非共价方式相互作用化d = 12. 2 + 3. InM)。其中a亚基 由61个氨基酸组成，包含3对二硫键，分子量为7. 26kD ;目亚基包含126个氨基酸，含有7 对二硫键，分子量为14. 50kD(见图3)。2个亚基本身不能激活感觉神经元，当二者结合后 细胞内Ca2+浓度很快增加。研究发现，MitTx可W激活同源或异源型酸敏感离子通道蛋白 (ASIC) la 巧Cs〇= 9. 4 ± 1.扣，化(EC 5。= 23 ± 3. 6nM)，对 ASIC3 有弱的作用巧C 5。= 830nM)。
[0003] 2014年Gouaux率先解析了小鸡ASICla全长与MitTx复合物的晶体结构。结构的 解析阐述了一种新的痛觉产生机制，同时也表明MitTX在该种痛觉产生机制上的重要性， 因此MitTx蛋白的提取与纯化工艺非常关键。从珊瑚蛇毒液中提取MitTx过程复杂、成本 昂贵，加之蛋白产量低，成分复杂等，使科研和应用大大受限。而且，MitTx特别是目亚基 分子内半脫氨酸数目多，且都形成了二硫键，该样一来合成折叠非常困难。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方 法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0006] 所述重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的制备方法包括如下步骤：
[0007] (1)优化MitTxa及MitTx目的编码序列，优化后的MitTxa的编码序列如SEQ ID NO. 1所示，优化后的MitTx目的编码序列如SEQ ID NO. 2所示；
[000引 似W优化后的MitTx a的编码序列为基础构建重组载体MitTx a -pET22b ; W优 化后的MitTx目的编码序列为基础构建重组载体MitTx目-pET22b ;所述重组载体MitTx a -pET22b的序列如SEQ ID NO. 3所示；所述重组载体MitTx目-pET22b的序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0009] (3)将重组载体MitTx a -pET2化和重组载体MitTx目-pET2化转化大肠杆菌，并 制备MitTx a包涵体和MitTx目包涵体；
[0010] (4)分别对MitTx a包涵体和MitTx目包涵体进行复性；将复性后的MitTx a包涵 体和MitTx目包涵体分离纯化，得到MitTx a蛋白和MitTx目蛋白，MitTx a蛋白和MitTx目 蛋白非共价结合，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。
[0011] 优选地，步骤（4)所述复性中，MitTx a包涵体的复性条件为；〇. 2M Arg-HCl (抑 8. 8)，32mM keys, ImM 脫氨酸；MitTx 目包涵体的复性条件为；50mM NDSB-201，0. 2M Arg-肥 1(抑 8. 8) ;32mM kcys，lmM 脫氨酸。
[0012] 优选地，步骤（4)所述MitTxa包涵体分离纯化包括透析去沉淀、阳离子交换、分 子筛层析的步骤；其中，透析时抑值调为5.0-5.5;MitTxa在mono S 5/50洗脱电导为 25ms/cm，在 superdex75 10/300 上洗脱体积为 17. 80-18. 20血。
[0013] 优选地，步骤（4)所述MitTx目包涵体分离纯化包括透析弃沉淀、阴离子交换、阳 离子交换、分子筛层析的步骤；其中，透析时抑值调至8. 5-9. 0,透析后用Mono Q阴离子 交换纯化收集流穿的MitTx目；Mono Q的流穿MitTx目再经抑5. 0-5. 5的20mM NaAC透 析后利用Mono S进一步纯化，洗脱电导为25ms/cm，在superdex7510/300上洗脱体积为 13. 80-13. 90血。
[0014] 优选地，步骤（4)所述MitTx a蛋白和MitTx目蛋白非共价结合是将MitTx a 蛋白和MitTx目蛋白等比例混合，放置10 -20min后过Superdex75柱子，洗脱体积为 13. 46-13. 55mL时，得到重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx。
[0015] 优选地，其步骤（4)所述的所述MitTxa蛋白和MitTx目蛋白分别进行非变性凝 胶电泳，其MitTx a蛋白和MitTx目蛋白W非共价1:1方式结合，且MitTx复合物蛋白比单 独MitTx目蛋白在50mM NaAC体系中迁移率稍快。
[0016] 所述重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx优化编码序列包括如SEQ ID NO. 1所示的 MitTxa编码序列和如SEQ ID NO. 2所示的MitTx目编码序列；MitTx a编码序列编码的 MitTxa蛋白的序列如SEQ ID NO. 5所示，MitTx目编码序列编码的MitTx目蛋白的序列如 SEQ ID NO. 6所示，MitTxa蛋白和MitTx目蛋白为重组珊瑚蛇毒素蛋白MitTx的两个亚 基，MitTx a蛋白和MitTx目蛋白非共价连接。
[0017] 下面对本发明作进一步说明：
[001引1优化的基因序列
[0019] 根据大肠杆菌密码子偏爱性，应用生物信息学软件对已公布的MitTx a及 MitTx目氨基酸序列的编码序列进行不断优化，优化后送至南京金斯瑞合成。其特征在于 该基因序列可W高效表达蛋白合成后序列经Ndel和化〇1消化构建于祀T2化载体中。所 述的含有按照大肠杆菌偏爱密码子优化合成的编码MitTx a及MitTx目成熟肤的基因序 列的载体1^1义〇-9册57及1^1义目可^57，^及由此为基础构建的1^1义〇可612化及 MitTx目-pET2化重组载体，含有与上述MitTx编码DNA 90 % W上的同源性的DNA序列的表 达载体，但不限于祀T、地V220、pGEX、P犯等系列载体。
[0020] 2MitTx包涵体的制备
[0021] 将MitTx表达载体转化大肠杆菌化21值日3)中进行表达分析。然后进行高密度发 酵，当0D600达到16-18时添加终浓度为0. 5mM IPTG，37C诱导化，收获菌体。对发酵后的 细菌进行超声裂解，并反复用裂解buffer (Img/mL溶菌酶，1 % Triton X-100,500mMNaCl， lOmM 2-ME)进行反复洗涂3次W上，离也即得到包涵体。
[002引 3包涵体的复性
[0023] 对MitTxa包涵体和MitTx目包涵体分别进行复性，其特征在于2种蛋白亚基 的复性条件。经过复性条件的筛选与优化，最终得到MitTx a包涵体的复性条件最佳为： 0. 2M Arg-肥 1 (抑 8. 8)，32mM keys, ImM 脫氨酸。MitTx 目复性条件；50mM NDSB-201，0. 2M Arg-肥1(抑8.8) ;32mM kcys，lmM脫氨酸。复性后的包涵体进行分离纯化。4MitTxa纯 化
[0024] MitTx a纯化至少包括透析去沉淀，阳离子交换，分子筛层析。特征在于透析时抑 调为5. 0-5. 5 ;该蛋白亚基在mono S 5/50洗脱电导为25ms/cm, superdex;75 10/300上洗 脱体积为 17. 80-18. 20mL。
[00巧]5MitTx目纯化
[0026] MitTx目纯化至少包括透析弃沉淀，阴离子交换，阳离子交换W及分子筛层析。其 特征在于复性后先将抑调至8. 5-9. 0,样品经透析后用Mono Q阴离子交换纯化收集流穿样 品；Mono Q的流穿样品再经抑5. 0-5. 5的20mM NaAC透析后利用Mono S进一步纯化，洗 脱电导为25ms/cm左右，superdex;75 10/300上洗脱体积为13. 80-13. 90血。
[0027] 6MitTxa和MitTx目蛋白亚基结合
[002引根据权利4和权利5的要求，进行实验。2种亚基进行等比例混合，放置10-20min 后过Superdex75柱子。其特征在于复合物在13. 46-13. 55mL时洗脱。
[0029] 7MitTx a和MitTx目蛋白亚基结合的凝胶迁移实验
[0030] 根据权利4和权利5的要求MitTx a和MitTx目的结合实验，其特征在于电泳时 选用50mM NaAC,抑5. 0-5. 5 W及凝胶的配方；另一特征在于电泳时操作方法，包括样品处 理，混合样品比例，电泳时间W及电极连接方法。
[0031] 本发明的目的在于提供一种重组MitTx的制备方法，为大量制备MitTx奠定基础。 本发明利用基因工程技术，通过对MitTxa和目亚基的基因编码序列按照大肠杆菌密码子 进行优化，实现目的基因在大肠杆菌中高效表达。然后利用蛋白质复性技术使蛋白进行很 好地折叠，最后通过特有的纯化方式得到纯度较高且具有生物学活性的蛋白质。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0033] 本发明根据大肠杆菌mRNA密码子的偏爱性进行了序列优化，使蛋白表达量得到 提高，之后，对折叠条件进行不断优化，纯化过程不断改进，最终得到了纯度较高具有一定 生物学活性的蛋白纯品。该个发明为蛋白表达纯化特别是包涵体的折叠纯化提供了一种思 路，具有很重要的理论价值，由于MitTx本身重要性也使得该项发明具有很大的潜在实用 价值。本发明可W得到MitTx蛋白纯品，可用于大规模生产和纯化，节约了纯化成本提高纯 化效率。
【附图说明】
[0034] 图1是优化后MitTx a的基因序列及其编码的氨基酸序列；
[00巧]图2是优化后MitTx目的基因序列及其编码的氨基酸序列；
[0036] 图3是MitTx a和MitTx目蛋白的二硫键结合方式图；
[0037] 图4MitTxa和MitTx目蛋白预表达分析；
[003引 图5MitTxa和MitTx目折叠条件筛选；
[0039] 图6MitTxa蛋白纯化及电泳图；
[0040] 图7MitTx目纯化及电泳图；
[0041] 图8是MitTx a和MitTx目结合gel filtr