大规模制备肝干细胞的方法与用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种肝干细胞化巧atic stem cells, HSCs)的制备方法，具体涉及 HSCs的分离、培养和干细胞纯化及大规模扩增培养HSCs的方法及其在细胞移植、干细胞培 养、组织工程，再生医学和药学方面的应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞是正常人体内存在的细胞群体，具有高度自我复制和高度的分化能力。近 年来随着干细胞研究的深入，人们发现利用干细胞可再生各种组织器官，如肝脏、膜腺、神 经组织、骨骼、肌膊等。
[0003] 因来源和分离的原因，现阶段临床应用的干细胞主要有成人骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)和造血干细胞（hematopoietic stem cells,服Cs)、人外周血干细胞、人胚胎来源的干细胞和厮带血造血干细胞及胎盘或厮带间 充质干细胞。按服Cs来源分为：骨髓移植（BMT)、外周血造血干细胞移植（PBS缓冲液CT)、 厮带血干细胞移植、纯化的CD34+细胞移植、胎肝服CT。按免疫遗传学分为；异基因干细胞 移植、同基因干细胞移植、自体干细胞移植。
[0004] 干细胞领域研究最多和最清楚的仍是造血干细胞，它在基础与临床应用研究处干 细胞的最前沿，并不断为其它干细胞研究提供理论和实践的指导和依据。
[0005] 干细胞可分为长期亚群和短期亚群，长期亚群具有无限的自我更新能力，在个体 中持续终生，短期亚群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力仅维持8周左右；根 据分化功能不同，干细胞分为全能性干细胞、多能性干细胞和单能性干细胞，个体形成中最 早的干细胞为全能性干细胞，包括受精卵及胚泡的内细胞团。全能性干细胞进一步形成原 始的生殖干细胞及体干/祖细胞，并最终分化形成各种组织干细胞(如NSCs，肝干细胞，膜 岛干细胞等)。
[0006] 肝干细胞化epatic stem cels,服Cs)则是来源于肝组织的干细胞。有研究表明， 肝干细胞可W分化为肝细胞和胆管上皮细胞等多种细胞
[0007] 现阶段人胚胎肝组织的分离和培养主要是从健康孕妇8~20周孕龄自然流产的 胎儿，无菌条件下分离胚胎肝组织，制备成细胞息液后接种于含有碱性成纤维细胞生长因 子化FGF)、表皮生长因子巧G巧和B27因子的无血清培养液中，接种密度为IXloVml。生 长为类上皮细胞后，每隔7~lOd传代1次，接种密度为（7. 5~10) X lOYml ;再次长满后 用于移植手术。此制备方法可有效地从胎肝组织中分离到服Cs,但其缺点是一次只能从胎 肝组织中最多分离到1〇 8的肝细胞，经培养后服Cs的数量仅为107。而据文献报道，治愈一 个重型肝炎病人需用1〇9肝细胞，因此，用原始的方法提取的肝细胞，只能用于0. 1-1个病 人，加之胎肝来源有限，很大程度上限制了 HSCs的临床推广应用。
[0008] 服Cs来源与扩增困难是限制其成为药物研发的主要障碍。
[0009] 名称为"一种分离猪肝干细胞的方法"（专利号；ZL03156803.3,授权公告号： CN1233821C)的发明专利公开了一种采用大部分肝切除、酶消化与密度梯度离也法分离出 猪肝干细胞的方法，其步骤包括：大部分肝切除促进肝再生、胶原酶将肝组织消化为单个细 胞、离也去除肝内的成纤维细胞、蛋白酶E特异性消化肝实质细胞，Percoll密度梯度离也 进一步纯化，获得纯度高、数量多且活性好的猪肝干细胞。但是，该方法应用剪碎法加酶消 化法提取的猪肝干细胞，细胞数仅为4. 8-6. 4X lOV叶猪肝(约500g)，难W满足临床需求。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供了一种可大规模制备肝干细胞的方法及其用途，并提供了 将该方法制备的肝干细胞用于HSCs的体外分离培养、扩增，再生修复，组织工程，肝脏疾病 治疗药物的用途。
[0011] 发明人在多年干细胞的研究中发现，从胎鼠肝中可分离到服Cs，之后又从人胎肝 中分离到服Cs，但分离到的服Cs数量极小，难W满足临床需求，因此，服Cs的产量成为了其 大规模临床应用的主要瓶颈。自2009年12月始，立项进行服Cs产量的研究，经H年多的 实验研究，经多次工艺改造后使服Cs从原有的lOV次增加到现在1〇 9-17次，经培养扩增后 细胞数可达l〇iwi/次，肝干细胞数量增加约100倍-10000倍；大大方便了临床操作。
[0012] 经发明人反复探索，发现采用机械法(手动或电动）可有效地从肝组织中分离 HSCs,经胶原酶和膜酶联合揽拌消化，细胞数明显增加，经15-20天的培养扩增，细胞总数 可达个/次，其中干细胞比例可达10-20%，此服Cs可低温长期保存，大大方便了临床 操作。
[0013] 本发明所述的一种规模化制备肝干细胞的方法，包括W下步骤：
[0014] A、称取幼年动物或胚胎肝组织，加入10至100倍体积的0. 1M/L PBS缓冲液，采用 机械法剪碎，绞碎或匀浆；
[00巧]B、离也，去上清，沉淀用0. 001%-1%胶原酶37C揽拌4°C -37C消化10分钟至24 小时，收集细胞，细胞计数和存活率检测；用10至100倍体积的0. 1MPBS缓冲液洗涂1~3 次，离也，去上清，沉淀用0. 〇〇1%-2. 5%的膜酶4°C -37C消化10分钟至24小时，收集细胞， 细胞计数和存活率检测；
[001引 C、用10-100倍体积的0. 1M PBS缓冲液将沉淀洗出，加0. 001%-1%胶原酶、 0. 001%-0. 5%蛋白酶K、0. 0001%-0. 05%面ase继续揽拌4°C -37°C消化10分钟至24小时， 0. 1M PBS缓冲液洗涂3次，沉淀用10-100倍体积的0. 1M PBS缓冲液洗出上层息浮细胞，过 滤，离也后进行细胞计数和存活率检测；
[0017] 在步骤C中，优选10倍体积的0. 1MPBS缓冲液将沉淀洗出，优选0. 01%胶原酶， 0. 02%的蛋白酶K，0. 005%的DNA酶37°C消化30分钟；
[001引 D、50ml离也管中加入肝干细胞分离液（比重1. 120)，取上述细胞按IXloVml 细胞息浮液约l0ml-20ml，小也加至分离液之上，离也，取分离液与上清液界面的细胞，用 0. 1MPBS缓冲液洗涂3次，细胞计数；
[0019] E、用比重为1. 070-1. 077的淋己细胞分离液纯化肝干细胞；
[0020] 在本发明的一个具体实施例中，将淋己细胞分离液20ml加入50ml离也管中，取上 述细胞息液20ml，匀速加至淋己细胞分离液之上，500-2000g离也15分钟，取细胞沉淀用 PBS缓冲液洗出，细胞计数和存活率检测；
[0021] F、取上述细胞按1 X lOVml进行培养，培养基为DMEM/F12培养基，内加bFGF、EGF 和胎牛血清，当细胞长满约90%密度培且细胞生长为H角样细胞后，采用膜酶消化法收集 肝干细胞，传代，接种密度为1 X l〇5/ml继续培养；
[0022] G、加入贴壁材料或磁珠，采用摆瓶法或转瓶法进行大规模细胞扩增，同时保持肝 干细胞未分化；
[0023] H、当细胞扩增10-10000倍后收集细胞，经检测符合肝干细胞的特征，按1-2 X lOV ml进行细胞冻存，备用。
[0024] 经培养后服Cs在形态上呈多角型，均质性，高表达CD133、CD90、CD44、CD40, CK7， CK8和nestin，低表达CD34、CD45,因此W下均称为服Cs。
[00巧]细胞复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，也符合肝干细胞的特征。
[0026] 根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述肝组织是来自 包括人类W及小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、马等幼年动物的肝脏。
[0027] 根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤A中，所 述的机械法包括；手动法(剪刀，研磨和匀浆法)，电动法(组织绞碎机，研磨机和匀浆机）；匀 浆速度和处理时间是取决于组织匀浆液的均匀度和细胞存活率。
[0028] 根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤A中，所 述PBS缓冲液与肝组织的重量比为10 ;1。
[0029] 根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤B和C中， 所述的胶原酶浓度为0. 1%，消化30分钟。
[0030] 所述的胶原酶浓度取决于所用胶原酶的活力单位，所消化的时间因温度不同可 为10分钟至24小时不等，由最后所得的细胞数和细胞活力决定，优选0. 1%的II胶原酶 (sigma公司）37C消化30分钟。
[0031] 根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤F中，所 述膜酶消化法中，膜酶浓度为0. 125%，37C消化30分钟。
[0032] 所述的膜酶浓度取决于所用膜酶的活力单位，所消化的时间因温度不同可为10 分钟至24小时不等，由最后所得的细胞数和细胞活力决定。
[0033] 根据本发明所述的大规模制备肝干细胞的方法的进一步特征，所述步骤E中，所 述的纯化方法是摆瓶法或者转瓶法，内加或不加支持物。
[0034] 通常分离纯化服Cs的方法可包括；（1)贴壁分离法。该法主要利用干细胞具有在 塑料培养瓶中贴壁生长特性的差异将干细胞与其它细胞相分离。（2)流式细胞分选法。该 法是根据干细胞体积小、相对缺少颗粒和独特的表面标志等特性对其加W分离。（3)免疫 磁珠法。该法是根据免疫学原理，利用包备有抗体的磁珠与干细胞表面的一些特殊标志如 CD133, nestin蛋白特异结合，通过一定强度磁场时被滞留而分选。
[00巧]然而，本发明需