两阶段热对流装置及其用图
【专利说明】
[OOOU 本申请是申请日为2011年1月11日、申请号为"201180013705. 1"、发明名称 为"两阶段热对流装置及其用途"的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/ IB2011/050104的中国国家阶段申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2010年1月12日提交的美国临时申请No. 61/294, 446的优先权， 其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本发明的特征是多阶段热对流装置（特别是两阶段热对流装置）及其用途。所 述装置包含至少一个辅助聚合酶链式反应（PCR)的温度成形元件（temperature shaping element)。本发明有多种应用，包括在无需与现有设备相关的笨重且通常昂贵的硬件的情 况下扩增DNA模板。在一个实施方案中，该装置可W放于使用者手掌上用作便携式PCR扩 增设备。
【背景技术】
[0005] 聚合酶链式反应（PCR)是在每次温度变化循环完成时扩增多核巧酸序列的技 术。参见例如，PCR;A Practical A卵roach，M.J.McPherson 等，1化 Press(1991) ;PCR Protocols ；A Guide to Methods andApplications，Innis 等，Academic Press (1990)郝 PCR Technology ；Principals and Applications for DNA Amplification，比 A.Erlich， Stockton Press (1989)。在许多专利（包括美国专利 No. 4, 683, 195、4, 683, 202、 4, 800, 159、4, 965, 188、4, 889, 818、5, 075, 216、5, 079, 352、5, 104, 792、5, 023, 171、 5, 091，310 和 5, 066, 584)中也描述了 PCR。
[0006] 在许多应用中，PCR设及使目的多核巧酸（"模板"）变性，然后使期望的引物寡核 巧酸（"引物"）与变性的模板退火。退火之后，聚合酶催化合成新多核巧酸链，其包含引 物并且对其进行延伸。该一系列的步骤（变性、引物退火和引物延伸）构成一个PCR循环。 该些步骤在PCR扩增过程中重复多次。
[0007] 随着循环的重复，新合成的多核巧酸的量W几何级数增加。在许多实施方案中，引 物是成对选择的，它们可W与给定双链多核巧酸的相对链退火。在该种情况下，可W扩增两 个退火位置之间的区域。
[0008] 需要多在多循环PCR实验中改变反应混合物的温度。例如，DNA变性通常在约90°C 至约98°C或更高的温度下发生，引物与变性DM的退火通常在约45°C至约65°C下进行，而 用聚合酶延伸退火引物的步骤通常在约65°C至约75°C下进行。为了使PCR W最佳状态进 行，该些温度步骤必须被依次重复。
[0009] 为了满足该需要，已开发多种市售设备用于进行PCR。许多设备的重要组件是热 "循环仪"，其中的一个或更多个温度控制元件（有时称为"加热块"）容纳PCR样品。在一 段时间中加热块的温度变化W支持热循环。遗憾的是，该些设备有重大缺点。
[0010] 例如，大多数设备是巨大、笨重且通常昂贵的。通常需要大量电力来加热和冷却加 热块W支持热循环。使用者常常需要接受大量培训。因此，该些设备一般不适于现场使用。
[0011] 克服该些问题的尝试并不是完全成功的。例如，一种尝试设及使用多个温度控制 加热块，其中每个块保持在期望的温度并且使样品在加热块之间移动。但是，该些装置有其 他缺点，如需要复杂的机械装置使样品在不同加热块之间移动，W及需要一次加热或冷却 一个或几个加热块。
[001引已有一些在一些PCR过程中使用热对流的尝试。参见Krishnan，M.等.（2002) Science 298 ;793 ;Wheeler，E. K. (2004) Anal. Chem. 76 ;4011-4016 ;化aim, D. (2004) Modern Physics Letters 18:775-784;和 W002/072267。但是，该些尝试都没有生产出小 型、便携、更实惠，而且减少对电力的大量需求的热对流PCR设备。而且，该些热对流装置往 往有低的PCR扩增效率和扩增子尺寸的限制。
【发明内容】
[0013] 本发明提供了多阶段热对流装置（特别是两阶段热对流装置）及其用途。该装置 通常包含至少一个辅助聚合酶链式反应（PCR)的温度成形元件。如下文所述，典型的温度 成形元件是该装置中支持热对流PCR的结构和/或位置特征。温度成形元件的存在增加 PCR扩增的效率和速度、支持小型化、并且减少对大量电力的需要。在一个实施方案中，该装 置容易地放于使用者手掌上并且具有电池足W运行的低电力需求。在该实施方案中，该装 置比许多现有PCR设备更小、更便宜且更便携。
[0014] 因此，在一方面，本发明的特征是适于进行热对流PCR扩增的两阶段热对流装置 ("装置"）。优选地，该装置具有至少一个（优选所有的）作为可操作连接组件的下述元 件：
[0015] (a)用于对槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第一热源，所述槽适于 容纳进行PCR的反应容器，
[0016] 化）用于对所述槽进行加热或冷却并且包含上表面和下表面的第二热源，所述下 表面朝向第一热源的上表面，其中所述槽由接触第一热源的底端和与第二热源的上表面邻 接的通孔限定，并且其中底端与通孔的中屯、点之间形成槽轴，围绕其布置所述槽，
[0017] (C)至少一个适于辅助热对流PCR的温度成形元件；W及
[0018] (d)在第一热源内适于容纳所述槽的接收孔。
[0019] 还提供了制造上述装置的方法，该方法包括W足W进行本文所述热对流PCR的可 操作组合组装（a)-(d)中的每个。
[0020] 在本发明的另一方面中，提供了适于使用至少一种本文所述装置进行PCR的热对 流PCR离屯、机（叩CR离屯、机"）。
[0021] 本发明还提供了通过热对流进行聚合酶链式反应（PCR)的方法。在一个实施方案 中，该方法包括至少一个（优选所有的）下述步骤：
[0022] (a)将包含接收孔的第一热源维持在适于使双链核酸分子变性并形成单链模板的 温度范围内，
[0023] 化）将第二热源维持在适于使至少一条寡核巧酸引物与单链模板退火的温度范围 内，W及
[0024] (c)在足W产生引物延伸产物的条件下在接收孔和第二热源之间产生热对流。
[0025] 另一方面，本发明提供了适于被本发明装置容纳的反应容器。
【附图说明】
[0026] 图1为示意图，其显示装置的一个实施方案的俯视图。示出了穿过装置的剖面 (A-A 和 B-B)。
[0027] 图2A至C为示意图，其显示具有第一室100的装置的一个实施方案的剖面图。图 2A至C为沿A-A面（图2A、2B)和B-B面（图2C)的横截面图。
[002引图3A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。每个装置具 有相对于槽轴80宽度不等的第一室100和第二室110。
[0029] 图4A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图（A-A)。图4B显示区域 (由图4A中的虚线圆确定）的放大图。装置具有第一室100和第二室110。第一室与第二 室之间的区域包含第一热制动器130。
[0030] 图5A至C为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图。图5A至C为沿A-A面 (图5A至B)和B-B面（图5C)的截面图。第二热源30包含第一室100和围绕槽轴80对 称布置并且延伸了第一室100的长度的第一突出部33。第一热源20包含第一突出部23。 [003U 图6A至C为沿A-A面（图6A至B)和B-B面（图6C)的装置的一个实施方案的 示意图。第一热源20和第二热源30包含突出部（23、24、33、34)，它们各自围绕槽轴80对 称布置。第二热源30包含第一室100。
[0032] 图7A至D为示意图，其显示装置的槽的一些实施方案（A-A面）。
[0033] 图8A至J为示意图，其显示装置的槽的一些实施方案。剖面与槽轴80垂直。
[0034] 图9A至I为图示，其显示装置的多种室的一些实施方案。剖面与槽轴80垂直。阴 影线部分表示第二或第一热源。
[0035] 图10A至P为图示，其显示装置的多种室和槽的一些实施方案。剖面与槽轴80垂 直。阴影线部分表示第二或第一热源。
[0036] 图11A至B为示意图，其显示多种定位实施方案。图11A显示图5A所示装置的定 位实施方案。装置相对于重力方向倾斜（倾斜0g确定的角度）。
[0037] 图11B显示装置的一个实施方案，其中在第二热源30中槽70和第一室100相对 于重力方向倾斜。重力方向相对于热源保持垂直。
[003引图12A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案的剖面图（A-A面）。第一室100 为锥形。
[0039] 图13A至B是示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图（A-A面），该装置实施 方案具有在第二热源30内位于第一室100与第二室110之间的第一热制动器130。显示的 第一和第二室的宽度不同。图13B显示由图13A中所示虚线圆所确定之区域的放大图，用 W说明第一热制动器130的结构细节。
[0040] 图14A至D是示意图，其显示装置的一些实施方案的剖面图（A-A面），该装置实施 方案具有位于第一室100的底部（即，第二热源30的底部）的第一热制动器130。图14B 和D显示了分别由图14A和D中所示虚线圆所确定之区域的放大图，用W说明第一热制动 器130的结构细节。在图14A至B中第一室100具有直壁，在图14C至D中具有锥形壁。
[0041] 图15为示意图，其显示装置的一个实施方案的剖面图（A-A)。接收孔73围绕槽轴 80不对称布置并形成接收孔间隙74。
[0042] 图16A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。第一热源 20包含接收孔间隙74。在由图16B所示的实施方案中，接收孔间隙74包含相对于槽轴80 倾斜的上表面。
[0043] 图17A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。第一热源 20的特征为突出部23围绕接收孔73不对称布置。在图17A中，与接收孔73相邻的突出部 23具有多个上表面，其中之一更高并且更接近第一室100。在图17B中，突出部23具有一 个相对于槽轴80倾斜的上表面，从而使一侧与相对于接收孔73的另一侧相比更高且更接 近第一室100。
[0044] 图18A至D为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。在该些实 施方案中，第一热源20和第二热源30的特征为突出部23和33围绕槽轴80不对称布置。 突出部23和33的一侧与相对于槽轴80的另一侧相比更高。突出部23的顶端和突出部33 的底端具有多个表面（图18A和18C)或相对于槽轴80倾斜（图18B和18D)。在图18A和 18B中，第一室100的特征为底端102,其一部分与相对于槽轴80的另一部分相比更接近突 出部23的一侧。在图18C和18D中，第一室100的底端102与突出部23上表面的距离基 本恒定。
[0045] 图19A至B为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图。在该些实 施方案中，第一热源20的特征为突出部23围绕接收孔73对称布置，第二热源30的特征为 突出部33围绕槽轴80不对称布置。在图19A中，第一室100的底端102的特征为具有多 个表面，从而使底端102 -侧的一部分比与槽轴80相对的另一部分更接近突出部23。在图 19B中，第一室100的底端102相对于槽轴80倾斜，从而使底端102的一部分比与槽轴80 相对的另一部分更接近突出部23。
[0046] 图20A至C为显示多种装置实施方案的示意图。图20A显示装置的一个实施方案 的剖面图，其中第一室100在第二热源30内并且围绕槽70不对称（偏离中屯、）布置。图 20B至C显示沿A-A面的装置的一个实施方案的剖面图。第一室100围绕槽70不对称布 置。如图20C所示，显示热制动器130围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。
[0047] 图21为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其显示在第二热 源30内，第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。
[0048] 图22为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室100 包含相对于槽轴80 W-定角度布置的壁103。
[0049] 图23A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第二热 源30内有第一室100和第二室110。如图23B所示，该装置的特征为第一热制动器130围 绕槽70不对称布置且处于第一室100和第二室110之间，其壁133接触槽70的一侧。 [0化0] 图24A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。在 图24B所示的放大图中，显示热制动器130围绕槽70对称布置在第一室100和第二室110 之间。热制动器130的壁133接触槽70。
[0化1] 图24C至D为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。 第一室100垂直于槽轴80的宽度小于第二室110沿槽轴80的宽度。在图24D所示的放大 图中，显示第一热制动器130围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。
[0052] 图25A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110沿A-A面W相反方向围绕槽 轴80不对称布置。显示热制动器130围绕槽70对称布置并且壁133接触槽70。
[0化3] 图26A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内。第一室100和第二室110围绕槽轴80不对称布置。 如图26B所示，第一热制动器130也围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。 [0化4] 图26C至D为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内并且围绕槽轴80不对称布置。如图2抓所示，第一热制 动器130也围绕槽70不对称布置并且壁133接触槽70的一侧。
[0化5] 图27A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内并且沿A-A面W相反方向围绕槽轴80不对称布置。在 图27B所示的放大图中，显示在第一室100中，第一热制动器130不对称布置并且壁133接 触槽70的一侧。还显示在第二室110中，第二热制动器140不对称布置并且壁143接触槽 70的一侧。第一热制动器130的顶端131基本位于与第二热制动器140的底端142相同的 高度。
[0化6] 图27C至D为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内并且沿A-A面W相反方向围绕槽轴80不对称布置。在 图27D所示的放大图中，显示第一热制动器130和第二热制动器140不对称布置并且其壁 (133、143)各自接触槽70的一侧。第一热制动器130顶端131所处的位置高于第二热制动 器140的底端142。
[0化7] 图27E至F为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内并且沿A-A面W相反方向围绕槽轴80不对称布置。在 图27F所示的放大图中，显示第一热制动器130和第二热制动器140不对称布置并且其壁 (133、143)各自接触槽70的一侧。显示第一热制动器130顶端131所处的位置低于第二热 制动器140的底端142。
[0化引图28A至B为示意图，其显示装置的一个实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内并且围绕槽轴80不对称布置。第一室100的顶端101 和第二室110的底端112相对于槽轴80倾斜。第一室100的壁103和第二室110的壁113 各自与槽轴80基本平行。在图28B所示的放大图中，显示第一热制动器130相对于槽轴80 倾斜并且壁133接触槽70。
[0化9] 图29A至D为示意图，其显示装置的一些实施方案沿A-A面的剖面图，其中第一室 100和第二室110在第二热源30内并且围绕槽轴80不对称布置。在图29A至D中，显示 第一室100的壁103和第二室110的壁113相对于槽轴80倾斜。在图29B所示的放大图 中，显示热制动器130围绕槽70对称布置并且壁133与槽70接触。在图29D所示的放大 图中，显示第一热制动器130相对于槽轴80倾斜并且壁133接触槽70。
[0060] 图30为示意图，其显示装置10的一个实施方案的俯视图，显示第一固定元件200、 第二固定元件210、加热/冷却元件（160a至b)和温度传感器（170a至b)。指示了多个剖 面（A-A、B-B 和 C-C)。
[0061 ] 图31A至B为示意图，其显示图30所示的装置实施方案沿A-A (图31A)和B-B (图 31B)面的截面图。
[0062] 图32为第一固定元件200沿C-C面的截面图的示意图。
[0063] 图33为装置一个实施方案的俯视图的示意图，其显示多个固定元件、热源结构、 加热/冷却元件和温度传感器。
[0064] 图34A至B为装置一个实施方案的俯视图（图34A)和截面图（图34B)的示意图， 显示第一壳体元件300,其限定出第二绝热体310和第=绝热体320。
[00化]图35A至B为装置一个实施方案的俯视图（图35A)和截面图（图35B)的示意图， 其包含第二壳体元件400和第四绝热体410及第五绝热体420。
[0066] 图36A至B为一个PCR离屯、机的一个实施方案的示意图。图36A显示俯视图，图 3她显示沿A-A面的截面图。
[0067] 图37为示意图，其显示PCR离屯、机装置的一个实施方案沿A-A面的截面图。
[0068] 图38A至B为示意图，其显示包含第一室的PCR离屯、机的实施方案。在图38A中， 沿A-A的剖面穿过槽70。在图38B中，沿B-B的剖面穿过第一固定工具200和第二固定工 具 210。
[0069] 图39A至B为示意图，其显示用于图38A至B所示PCR离屯、机的第一热源（图39A) 和第二热源（图39B)的一些实施方案。指示了穿过装置的剖面（A-A和B-B)。
[0070] 图40A至D为不意图，其显不多种反应容器实施方案的截面图。
[0071] 图41A至J为示意图，其显示多种反应容器实施方案垂直于反应容器轴95的截面 图。
[007引图42A至C为使用图5A的装置进行热对流PCR的结果，其显示用使用分别来自 Takara Bio、Finnzymes和Kapa Biosystems的3种不同DNA聚合酶扩增来自Ing质粒样 品的349bp序列。
[0073] 图43显示使用图5A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自Ing质粒样品的 936bp序列的扩增。
[0074] 图44A至D为使用图5A的装置进行热对流PCR的结果，其显示在提高的变性温度 (分别为98°C、100°C、102°C和104°C )下PCR扩增加速。
[0075] 图45A至B为使用图5A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自long人基因 组样品的479bp GAPDH(图45A)和363bp 0 -珠蛋白（图45B)序列的扩增。
[0076] 图46为使用图5A的装置进行热对流PCR的结果，其显示来自非常低拷贝的人基 因组样品的24化P 0 -肌动蛋白序列的扩增。
[0077] 图47显示当将目标温度分别设定为98°C和64°C时，图5A装置的第一和第二热源 作为时间的函数的温度变化。
[007引图48显示了具有12个槽的图5A的装置作为时间的函数的功率消耗。
[0079] 图49A至E为使用图11A的装置进行热对流PCR的结果，其显示作为重力倾斜角 度的函数的对349bp质粒祀标的PCR扩增加速。图49A至E的重力倾斜角度分别为0°、 10。、20。、30。和 45°。
[0080] 图50A至E为使用图llA的装置进行热对流PCR的结果，其显示作为重力倾斜角度 函数的对936bp质粒祀标的PCR扩增加速。图50A至E的重力倾斜角度分别为0°、10°、 20°、30° 和 45°。
[OOW] 图51显示使用图11A的装置进行热对流PCR的结果，其显示了来自Ing质粒样品 的多个目标序列（大小为约150bp至约化bp)的扩增。重力倾斜角度为10°。
[0082] 图52A至E为使用图11A的装置进行热对流PCR的结果，其显示作为重力倾斜角度 的函数的对52化P人基因组祀标的PCR扩增加速。图52A至E的重力倾斜角度分别为0°、 10。、20。、30。和 45°。
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