植物耐逆性相关蛋白VrDREB2A及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种植物耐逆性相关蛋白VrDREB2A及 其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 非生物胁迫如盐碱、干旱、低温、臭氧、辐射及重金属等严重制约着植物的生长发 育，是农作物产量与质量的制约因素。在长期进化过程中，植物通过细胞分子水平的耐受和 植株整体水平的协同应答形成了一系列完善的逆境胁迫应答机制。
[0003] DREB类转录因子基因属于AP2/EREBP类基因家族，能够与抗逆基因启动子区域的 DRE顺式作用元件结合，参与非生物胁迫应答反应，增强植物的抗逆性。有科学家证明了拟 南芥DREB2A被脱水、高盐胁迫诱导，同时DREB2A转录因子可激活具有DRE顺式作用元件的 一系列目的基因的表达，如rd29A、corl5a、rdl7和kinl等，这些基因表达的产物在植物抗 逆反应中发挥了不同的功能，此实验说明DREB2A蛋白直接参与植物抗逆的过程中。在提高 作物对环境胁迫的分子育种中，在将DREB2A蛋白导入到植物体内可以直接提高植物的抗 逆性。
[0004] 绿豆（Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)，属于豆科，在中国已有两千年的栽培历 史。是我国重要的粮食作物。因其具有重要的营养价值和医用价值，现已作为重要的功能型 食品进行开发。近年来，随着种植业结构的调整和人们膳食结构的改变，人们对绿豆的需求 量日益增加，种植面积卒年扩大。研宄表明非生物胁迫严重影响绿豆种子萌发、幼苗生长、 产量等方面。鉴于此，深入研宄绿豆DREB2A参与非生物胁迫的机理，对筛选出抗旱性较强 的品种及抗旱育种材料的筛选具有十分重要的意义，也是解决干旱条件下绿豆生产的最佳 途径之。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白 VrDREB2A及其编码基因与应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种植物耐逆性相关蛋白VrDREB2A，来源 于绿豆（Vigna radiata(Linn.)Wilczek.)，其氨基酸序列如SEQ ID No.l所示，或该序列经 替换和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007] 所述一个或几个氨基酸残基的替换和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸 残基的替换和/或缺失和/或添加。
[0008] 本发明还提供了一种与植物耐逆性相关的基因VrDREB2A，所述基因可编码前述植 物耐逆性相关蛋白VrDREB2A。
[0009] 进一步地，所述基因含有如SEQIDNo.2中第3-1160bp所示的核苷酸序列。
[0010] 更进一步地，当所述基因用于构建重组载体、工程菌、转基因细胞系或表达盒时， 可根据本领域常规技术在其末端构建酶切位点。
[0011] 在本发明的一个【具体实施方式】中，本发明提供一个5'末端的第1-6位核苷酸是 Ncol酶切位点，第1161-1166位核苷酸是Spel的酶切位点的核苷酸序列，该核苷酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。
[0012] 本发明还提供了用于扩增前述基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列分别如 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
[0013] 本发明还提供了含有前述基因的载体，所述载体为将前述基因插入载体 PCAMBIA1302的Ncol和Spel酶切位点之间得到的重组表达载体。
[0014] 本发明还提供了含有前述基因的工程菌。
[0015] 本发明还提供了前述基因在培育转基因植物提高耐逆性中的应用。
[0016] 进一步地，所述应用为利用前述重组表达载体或工程菌将所述与植物耐逆性相关 的基因VrDREB2A导入目的植物得到耐逆性提高的转基因植物。
[0017] 其中，所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
[0018] 所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥，如 Columbia生态型拟南芥。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 本发明的实验证明，本发明从豆科植物绿豆中筛选到一个转录因子基因 VrDREB2A，通过农杆菌转化法将VrDREB2A导入拟南芥，经过潮霉素初筛、分子检测、萌发期 盐胁迫和后期干旱胁迫等手段，筛选到抗盐和抗干旱能力显著提高的转基因拟南芥株系。 本发明对于培育耐盐、耐干旱的转基因豆科作物具有重要价值。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明所述载体pCAMBIA1302-VrDREB2A构建流程图。
[0022] 图2为代转基因拟南芥的PCR检测结果；
[0023]其中：M :lkb DNA ladder，由下到上分别为 250bp，500bp，750bp，1000bp， 1500bp，2000bp ;1:阴性对照，H20 ;3;阴性对照，野生型拟南芥；3:阳性对照， 口〇八1?从1302-￥扣1?824载体；4-13和16屮〇?鉴定阳性植株 ；14、15和17屮〇?鉴定阴性植 株。
[0024] 图3为^代转基因拟南芥在正常生长条件下，210mM和220mM NaCl胁迫下生长7d 的萌发率统计图。
[0025] 图4为1~3代转基因拟南芥干旱胁迫处理14d的存活率统计图。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0030] 中绿2号绿豆种子：由中国农业科学院作物科学研宄所培育（该种子向公众免费 赠予）。
[0031] Columbia生态型拟南芥（哥伦比亚生态型拟南芥（Columbia stain of Arabidopsis thaliana as genetic background):购自salk公司。
[0032]农杆菌 EHA105 记载在 Days to heading 7, a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity and regional adaptation in rice, He Gao et al，PNAS，2014, 111 (46)，16337 - 16342中，公众可以从中国农业科学院作物科学研宄所获 得。
[0033] 实施例lVrDREB2A基因的克隆
[0034]1、设计特异性引物对（VrDREB2A-5' 和 VrDREB2A-3'），由 Invitrogen 公司合成。
[0035] VrDREB2A-5' ：5' -ATGGGTGCTTATGATCAAGTTTCTGTG-3' ；
[0036] VrDREB2A-3 ' ： 5 ' -TCATTCCTTGCTTGCTAGCATTTCCTTTG-3 '。
[0037] 2、提取绿豆（Vigna radiata(Linn. )Wilczek.)整株植物的RNA，反转录为cDNA;
[0038] 3、以步骤2的cDNA为模板，用步骤1的特异性引物对VrDREB2A-5'和VrDREB2A-3' 进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0039] 4、将步骤3的PCR扩增产物进行测序。
[0040] 测序结果为，该PCR产物的基因的序列为序列表中的序列2,编码区为序列2的自 5'末端的第3-1166位核苷酸，自5'末端的第1-6位核苷酸是Ncol酶切位点，第1161-1166 位核苷酸是Spel的酶切位点。将该基因命名为VrDREB2A，该基因编码的蛋白命名为 VrDREB2A，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1所示，序列1由385个氨基酸残基组 成。
[0041] 5、将上述PCR产物插入pMD18T_simple载体（购自TaKaRa生物工程公司），得到 载体 pMD18T-simple-VrDREB2A，测序，结果为载体 pMD18T-simple-VrDREB2A 为将序列表中 的序列2插入pMD18T-simple载体得到的载体。
[0042] 实施例2转基因拟南芥的获得和功能研宄
[0043] -、转基因拟南芥的获得
[0044] 1、重组载体（pCAMBIA1302-VrDREB2A)的构建
[0045] 构建过程如图1所示。
[0046] (1)用限制性内切酶Ncol和Spel双酶切载体pMD18T-simple-VrDREB2A，回收小 片段。
[0047] (2)用限制性内切酶Ncol和Spel双酶切pCAMBIA1302(购自Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture, www. cambia. org), 回收载体骨架。
[0048] (3)将步骤⑴的小片段与步骤⑵的载体骨架连接，得到连接产物，将该连接产 物转化大肠杆菌DH5 a，得到转化子，提取转化子的质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列 表中的序列2插入pCAMBIA1302的Ncol和Spel酶切位点之间得到的重组载体，将该质粒 命名为pCAMBIA1302-VrDREB2A。
[0049] 2、转基因拟南芥的获得 [0050] (1)农杆菌感受态细胞的制备
[0051] 挑取农杆菌EHA105单菌落接种于100ml YEB液体培养基中，220rpm、28°C振荡培 养至0D6(i(i= 0. 5 ;转入无菌离心管，5000rpm离心5min，去上清，加入10ml预冷的0. 15M的 CaCljK溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min ;4°C、5000rpm离心5min，去上清，加入4ml预 冷的含10%甘油（体积百分含量）和0. 15M 0&(：12的水溶液，轻轻悬浮；得到农杆菌悬浮液 (EHA105感受态细胞），分装于无菌eppendorf管中，每管200 y 1，于液氮中速冻lmin，冻存 于-70°C。
[0052] (2) pCAMBIA1302-VrDREB2A 转化农杆菌 EHA105
[0053] 取lyg上述得到的pCAMBIA1302-VrDREB2A加入200 yl EHA105感受态细胞中， 混匀，