一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是生物医药及生物工程下游蛋白纯化领域，更具体的涉及了一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的工艺。
【背景技术】
[0002]革兰氏阴性细菌外膜蛋白对细菌抵抗有害物质或环境起着重要作用，它能够保护细胞免受或减少多种有害物质的影响，如蛋白酶、抗生素、毒素和噬菌体等，并且对维持革兰氏阴性细菌在高渗透压、酸性等胁迫条件下的生存起着重要作用。此外，外膜蛋白形成的非特异性的离子通道对革兰氏阴性细菌吸收营养物质和排泄自身代谢废物也起着关键作用。外膜蛋白也被称为膜孔蛋白，是外膜的主要组成成分，大肠杆菌重要的外膜蛋白有OmpC、OmpF和PhoE等，它们横跨脂质双分子层。在宿主体内，外膜蛋白的种类与浓度的变化均能令巨噬细胞的形态及功能发生改变；在体外，外膜蛋白具有与补体系统之间相互作用的能力。它既可作为佐剂，又可作为免疫刺激原得到应用，因而可应用于高效价抗体和疫苗的研发。鸡大肠杆菌外膜蛋白分子量为35?45KD的蛋白质，具有蛋白质通性，对热稳定，2-8°C可保存较长时间，20°C可长期保存其活性，易被核酸酶中和，可被蛋白酶灭活。基因工程重组鸡大肠杆菌外面膜蛋白C是无毒、无害、无残留的生物制品，对抑制病毒的复制和提高机体免疫力方面有一定的功效，因此，有望将其应用在禽类养殖业上，以期解决目前我国养殖业中存在的部分问题，为我国禽类健康保驾护航，为食品安全提供绿色保障。
[0003]大肠杆菌是目前最为被广泛用来表达外源蛋白的表达系统，然而大肠杆菌大量表达重组蛋白质常常导致其聚集体并形成蛋白沉淀一包涵体。包涵体蛋白没有生物活性，需要复杂的溶解，复性，纯化来的得到有功能的产品。
[0004]目前蛋白质复性通常有两种方法。一是稀释法，稀释溶有蛋白的变性液，溶液中变性剂浓度足够低时，蛋白开始复性；而是透析法，用透析、超滤等手段除去变性剂。稀释法操作液体量太大，同时蛋白质浓度太小，为后续的提纯蛋白增加困难，增加生产成本。透析法对设备要求较高，增加了设备的投入，同时操作时间较长，可能导致蛋白质沉淀。目前，包涵体的复性的回收率大概为15 — 25 %，大部分宝贵的目的蛋白因为不能复性而不能利用。复性率较低的原因是，在重组蛋白的复性过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适而无法形成正确的次级键等。
[0005]因此，如果能找到一种既能提高蛋白复性率，而且能有效降低复性成本的方法成为基因重组蛋白药物生产的一个关键性难题。
【发明内容】
[0006]为了克服现有的外膜蛋白包涵体在生产中包涵体复性方法需要复杂的操作步骤，周期长，而且回收率低的缺点，提供一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法。
[0007]本发明一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高效复性液对其复性的方法，包括以下步骤:
[0008](I)包涵体蛋白的提取:4°C，4000?6000rpm，10?20min，离心收集菌体，PBS洗涤菌体，4°C，6000?8000rpm，10?20min，将菌体超声破碎，功率400瓦，超声5秒，间歇25秒，工作时间20?35分钟，所述菌体为重组鸡大肠杆菌；然后4°C，8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷冻离心得到鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体蛋白质；
[0009](2)包涵体蛋白质的纯化:首先按质量体积比1:10?1:30将包涵体重悬于第一洗涤液中，所述洗涤液为:NaCl 137mmol/L, KCl 2.7mmol/L, Na2HPO41OmmoI/L,KH2P042mmol/L，0.2%?1.4%的 tritonX-100，pH 8.0 ?8.5 ；4°C,8000 ?lOOOOrpm，10 ?20min高速冷冻离心；然后按质量体积比1:10?1:30将包涵体重悬于第二洗涤液种，所述第二洗涤液为:1?3mol/L尿素；4°C，8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷冻离心；接着按质量体积比1:20?1:50将包涵体重悬于第三洗涤液中，所述第三洗涤液为:0.6?2mol/L NaCl,4°C,8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷冻离心；最后按质量体积比1:30?1:50将包涵体重悬于0.5?2%十二烷基硫酸钠(Sodium lauryl sulfate，简称SLS)，4°C，8000?lOOOOrpm，20?30min高速冷冻离心，收集沉淀；
[0010](3)包涵体蛋白质的溶解与复性，按质量体积比为1:10?I:40将步骤⑵得到的沉淀用变性剂重悬，所述变性剂为:5?7mol/L盐酸胍，I?2mmol/L EDTA，20?50mmol/L Tris-Base，6 ?10mmol/L DTT (即 DL-Dith1threitol，中文名:二硫苏糖醇)，pH 8.0 ?8.5 ;室温放置至沉淀逐渐溶解；4°C，8000?lOOOOrpm，10?20min高速冷冻离心，收集上清液；4°C条件下，使变性液逐滴加入复性缓冲液中，所述复性缓冲液为:0.2?0.8mol/L精氛酸，0.5 ?2mmo1 /T, EDTA, 0.3 ?0.9mmol/L氧化型谷脱甘狀，60 ?100mmol/L Tris-Base,15?30%甘油，pH 8.0?8.5，同时搅拌24?48h。
[0011]所述步骤(3)中变性液加入复性缓冲液中方式为滴加，变性液与复性缓冲液的体积比为1:20?I:50o
[0012]本发明具有如下有益效果:
[0013]本发明能够显著提高复性率，并且设备要求简单。本方法适当改变包涵体洗涤液的比例、组分和洗涤方法来纯化包涵体；通过适当改变复性缓冲液的复性剂、离子强度和复性方法等，提高了重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的复性率，简化了复性的步骤，节约了时间，从而大大降低了重组蛋白的生产的费用。对大规模工业生产具有指导意义。
[0014]该重组鸡大肠杆菌外膜蛋白纯化方法简便易行，无需进行过柱处理。本发明的包涵体蛋白的三步洗涤纯化工艺方法，使菌体蛋白与包涵体得到很好的分离，再通过复性溶液及点滴加样一次复性的工艺方法，使蛋白质的复性率大大提高，同时简化复性工艺及所需设备，从而大大提高目的蛋白的收获率，降低重组鸡大肠杆菌外膜蛋白的生产成本。
【具体实施方式】
[0015]为了实现上述目的，设计一种重组鸡大肠杆菌外膜蛋白包涵体的纯化及高