生物改性蓖麻蛋白质的制备方法及其在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的制备方法及其新用途，尤其是生物改性蓖麻蛋白质的制备 方法及其在制备抗恶性胸膜间皮瘤药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性胸膜间皮瘤是原发于胸膜间皮组织的一种胸膜肿瘤。大约80%的恶性胸膜间 皮瘤的患者与职业环境中接触各种石棉纤维有关，其它导致恶性胸膜间皮瘤的可能因素有 结核性胸膜炎、病毒感染、放射线辐射、特殊工业化合物的接触史以及遗传因素等。
[0003] 目前常用的治疗方法有手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗及分子靶向治 疗。
[0004] 中医则对症状分别以行气活血、利水逐饮、益气补阴、清热化痰等方式治疗。
[0005] CN103842823A公开了用于胸膜间皮瘤患者的早起发现的分子标志物及其表达分 析方法。该发明提供了间皮瘤的检测方法，包括受试者的血液和胸水中的至少任一种样品 中的人骨膜蛋白蛋白质浓度的测定方法。
[0006] CN101868249A公开了治疗间皮瘤的药物的方法，该方法涉及使用至少一种减毒的 麻瘆病毒来制备旨在治疗个体的恶性间皮瘤的药物。
[0007] CN102159709A公开了用于恶性间皮瘤的新型治疗剂和免疫刺激剂，该发明提供了 使用REIC/DKK-3来治疗恶性间皮瘤的方法和含有REIC/DKK-3的用于恶性间皮瘤的治疗 剂。
[0008] CN103288968A公开了一种抗肿瘤靶向复合物及其制备方法和应用，该发明涉及一 种抗肿瘤靶向复合物，该复合物是蝎氯毒素和蛙卵核糖核酸酶通过二硫键交联得到的化学 交联复合物CTX-0nC〇
[0009] 蓖麻是大戟科蓖麻属植物，蓖麻种子含有蓖麻毒素、血细胞凝集素等成分，蓖麻毒 素是一种蛋白质毒素，存在于蓖麻籽的蛋白质中。
[0010] 蓖麻毒素是由两条多肽链组成，N-末端的氨基酸是异亮氨酸（lie)和丙氨酸 (Ala)，根据末端氨基酸命名为lie链（即A链）和Ala链（即B链)，两链间由一个二硫键连 接。
[0011] 实验证明：以二硫键结合A链、B链的蓖麻毒素毒性很强，但是分离的A链、B链混 合在一起却没有毒性，故毒素的两链以二硫键的结合对毒性是重要的，这是一个奇妙的现 象。
[0012] 201210316220. 6公开了蓖麻蛋白的生物改性工艺，该发明生物改性过程首先诱导 昆虫逐渐嗜硫到一定程度后加入到含蓖麻毒素的培养基中，可以对蓖麻毒素A链与B链间 的双硫键快速进行切割，并与切割后的A链和B链分别产生抗性应答物，既消除蓖麻毒素的 毒性，又充分利用A链与B链的生物活性制备出一种独特蛋白。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种生物改性蓖麻蛋白质的制备方法及其在制备抗恶性胸 膜间皮瘤药品中的应用，利用生物改性蓖麻虫体为原料，经过分离纯化蛋白质，再用此蛋白 质制备各种剂型的药品，本过程工艺简要明了，药品成分明确，一致性好，疗效明显。
[0014] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000g生物改性蓖麻虫体在常温膨化装置（200520108339. X)中常温条件下膨化 粉碎。
[0015] 本步骤中，所述膨化压力为0?l~5MPa，时间为10~60min。
[0016] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出生物改性蓖麻蛋白质粗品。
[0017] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H20组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0018] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0019] (3)收集含有生物改性蓖麻蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0020] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0021] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的生物改性蓖麻蛋白质超滤溶液。
[0022] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0023] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0024] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0025] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0026] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0027] (7)纯化后的生物改性蓖麻蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0028] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0029] (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服剂、栓剂，可用于制备抗恶 性胸膜间皮瘤药品。
[0030] 本发明的优点和有益效果如下：通过本发明分离纯化的生物改性蓖麻蛋白 质用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为 11. 8~12. 6KPa ;用等电聚焦发测定其等电点为pH8. 2~9. 3 ;常规化学法分析结果表明其不 含糖类和磷酸基团；紫外分光光度法分析在260nm和280nm测定纯化的生物改性蓖麻蛋白 质含量为98. 2%;分子结构属非典型、非单一的昆虫蛋白质，链内与链间不含二硫键，其三 级结构构象单元以无规卷曲为主，a螺旋与0折叠的含量比例基本相当。本发明制备的 生物改性蓖麻蛋白质制剂质量稳定，结构清楚，药理明晰，疗效明显，含量可检可测，剂型多 样，成本较低，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0032] 实施例1: (1) 将1000g生物改性蓖麻虫体干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对 膨化装置内充入二氧化碳气体并加压至〇.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常 压，生物改性蓖麻虫体被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6) 中，加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 *H20,加压至2~10MPa，形成 膨胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，生物改性蓖麻粉体中的蛋白质溶解，然 后降压至常压，生成生物改性蓖麻蛋白粗品与甲醇-NH 3 ? H20的混合液； (3) 收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处 固体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的生物改性蓖麻蛋白超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm ; (7) 纯化后的生物改性蓖麻蛋白用真空