一种根癌农杆菌介导的亚麻芥遗传转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，尤其是一种根癌农杆菌介导的亚麻芥遗传转化方 法。
【背景技术】
[0002] 亚麻芥（Camelina sativa(L. )Crantz)属于十字花科，具有抗旱、抗寒、耐瘠、 耐盐碱、抗病虫害等优良特性，是一种低投入的油料作物。亚麻芥油中亚油酸含量为16%? 18 %，亚麻酸含量为36 %?40 %，天然维生素 E含量为42?48mg/100g，多不饱和脂肪酸总 含量超过60 %，不饱和脂肪酸总含量超过90 %。因此，亚麻芥油以其天然保健、化学稳定等 优点，被广泛应用于高档保健油、食品添加剂、医药、化妆品等许多领域。
[0003] 同时，随着化石能源消耗对全球政治、经济及环境所带来的负面效应的显现，化石 燃料的价格波动，政治动荡导致的供应不可靠，温室气体排放等因素，寻找开发清洁可替代 的可再生能源已成为紧迫任务。由于亚麻芥低成本、高收益、安全性高被广泛关注，随着对 其油脂及油脂甲酯理化性质和用其生产生物柴油可行性分析研究的不断深入，亚麻芥被认 定为发展潜力巨大的新兴生物燃油作物。燃料特性很大程度上取决于制备生物燃油原料的 脂肪酸组成，生物燃料要求更高的抗氧化能力、稳定性和燃烧特性，以高含单不饱和脂肪酸 油酸为较理想成分。为解决原料匮乏问题，全世界范围内都在积极寻找适合各地区气候与 生态条件的柴油植物品种，因此，通过遗传转化的方法对亚麻芥的遗传特性进行修饰，对于 获得高产量、高油酸含量、燃料特性好的亚麻芥品种具有重要的现实意义，将有力推动我国 在利用油料植物作为经济有效能源的研究和开发。
[0004] 在植物遗传转化中，比较传统的侵染方法包括：把地上部分直接侵入农杆菌悬浮 液中进行侵染和用微量取液器吸取农杆菌悬浮液直接滴在花蕾上进行侵染。这两种方法转 化效率低，且在浸染过程中易造成污染。目前，关于亚麻芥的遗传转化体系的建立鲜有报 道，因此，构建程序简单、转化效率高、重复性好的亚麻芥遗传转化体系仍是亚麻芥遗传改 良中亟需解决的问题。
[0005] 通过专利检索，尚未发现与本发明申请专利相关的专利公开文献。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服传统的亚麻芥遗传转化技术的不足，在传统浸染的基础 上，采用真空浸染转化装置，使用普通仪器，构建程序简单、转化效率高、重复性好的亚麻芥 遗传转化体系，提供一种以亚麻芥花序为转化受体，通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法， 把外源基因导入到亚麻芥受体细胞中，经过筛选再生，获得亚麻芥转基因植株。
[0007] 本发明实现目的的技术方案是：
[0008] -种根癌农杆菌介导的亚麻芥遗传转化方法，所述方法是将预培育的开花初期的 亚麻芥花序浸入含有目的基因和筛选基因质粒的根癌农杆菌菌液中，具体步骤如下：
[0009] ⑴工程菌株的构建与鉴定：采用CaClJi制备根癌农杆菌感受态细胞，平均分装数 管，24h内直接用于转化或液氮速冻后-80°C保存待用；将含有标记基因的载体质粒导入根 癌农杆菌感受态细胞中，每管中按根癌农杆菌感受态细胞=YEB液体培养基的体积比为1 :8 的比例加入YEB液体培养基，混匀后置于28°C环境中复苏2h ;4000?5000r/min室温下离 心45s，除去大部分上清液，取少部分上清液重悬菌体，少部分上清液与每管根癌农杆菌感 受态细胞的体积比为1 :1，将重悬菌体涂布到含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEB 固体抗性平板培养基上；28°C倒置培养24-48h，在YEB固体抗性平板培养基上得到抗性菌 落；
[0010] 从YEB固体抗性平板培养基上随机挑取新鲜培养的根癌农杆菌菌株的阳性单菌 落，接种到含50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素的YEB液体培养基中，28°C，180r/min 振荡培养过夜；碱裂法提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测后，酶切鉴定重组质粒，取鉴定转化 成功的根癌农杆菌单菌落待用；
[0011] ⑵待转化亚麻芥苗的准备：将蛭石、营养土、珍珠岩混合，该混合物要保证透气性 和土壤的营养，均匀播撒亚麻芥种子，覆膜2-3d以缓苗，保持在20/16°C (白天/夜晚）自 然光照种植培育，当亚麻芥植株20%以下的花序处于完全开放、60%以上处于含苞时期时 用于转化；
[0012] ⑶真空渗透介质的制备：挑取鉴定转化成功的根癌农杆菌单菌落接种于含50mg/ L利福平的YEB液体培养基中，28°C培养过夜得菌液；将菌液转接到体积为菌液本身100 倍的上述YEB液体培养基中，28°C、180r/min持续振荡培养24-48h，4000-6000r/min离心 lOmin，弃上清，用上述YEB液体培养基：无菌渗透培养基的体积比为I :40-60的比例的无 菌渗透培养基悬浮菌体，混合均匀，即制备得到转化植株的渗透介质，待用；
[0013] ⑷浸染与共培养：亚麻芥开花初期，把植株放入一个高于300mm的干燥器中，连 接一真空泵，使亚麻芥花序倒置浸没于盛有上述渗透介质的干燥器中，真空泵抽真空保持 85kPa转化5min ;然后，用保鲜袋套住亚麻芥花序，置黑暗条件下共培养24-48h，去袋，恢复 在20/16°C (白天/夜晚）自然光照培育，直到种荚成熟，收获Ttl代种子；
[0014] (5)转基因种子或植株的初筛：利用载体质粒所含有的标记基因对亚麻芥Ttl代种子 或播种T tl代种子而培育的T i代植株进行初筛；
[0015] (6)转基因植株的鉴定：培育T1代植株，以初筛阳性的植株叶片为材料，提取植株 DNA，针对标记基因或目的基因设计引物，采用PCR法鉴定是否可扩增出目的基因片段，若 鉴定成功，即得到亚麻芥转基因植株。
[0016] 而且，所述步骤⑴中载体质粒为具有卡那霉素抗性的pBGl 100,该质粒含有Bar抗 草丁膦除草剂标记基因。
[0017] 而且，所述步骤(5)、(6)的具体步骤如下：
[0018] (5)转基因种子或植株的初筛：载体质粒pBinGlyBarl中含有Bar抗草丁膦除草剂 标记基因，当植株生长到两叶期、茎长3cm时，将草丁膦除草剂与水以体积比为1:300的比 例混合得混合溶液，使用此混合溶液喷洒!\代亚麻芥幼苗；喷洒除草剂一周之内，大部分植 株由叶片开始卷曲、干枯直至整株死亡，极少数植株仍可正常存活，取可正常存活的植株， 即完成对转基因植株的初步筛选；
[0019] (6)转基因植株的鉴定：培育T1代植株，以初筛阳性的植株叶片为材料，提取植株模 板DNA，针对标记基因 Bar基因设计引物序列1/序列2进行PCR鉴定，转基因株系中能够扩 增出420bp的目的片段，即得到亚麻芥转基因植株。
[0020] 而且，所述步骤⑵中蛭石、营养土、珍珠岩按质量比为2:2:1比例混合；
[0021] 或者，所述YEB固体抗性平板培养基的每L组成为：1. Og/L酵母膏+5. Og/L牛肉 膏 +5. Og/L 蛋白胨 +0· 5g/L MgS04+5. Og/L 鹿糖 +15g/L 琼脂 +50mg/L 利福平 +50mg/L 卡那 霉素 ，pH 7· 0-7. 4。
[0022] 而且，所述YEB固体抗性平板培养基的制备如下：将各组份混合后，pH调至 7. 0-7. 4,121°C灭菌20min，待培养基温度降至60°C时，再添加利福平和卡那霉素，混匀倒 平板待用。
[0023] 而且，所述步骤⑶中无菌渗透培养基组成为：1/2MS培养基+糖的水溶液5% (占 该培养基总质量的质量百分数）+高效有机硅表面活性剂〇. 05% (占该培养基总体积的体 积百分数），PH 5.7。
[0024] 而且，所述糖的水溶液中糖为葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖或乳糖。
[0025] 而且，所述无菌渗透培养基的制备如下：1/2MS培养基+糖的水溶液5% (占该培 养基总质量的质量百分数），PH调至5. 7,经过121 °C灭菌20min，温度降至常温后，再添加 高效有机硅表面活性剂，混匀后的培养液用于悬浮菌体。
[0026] 而且，所述步骤(5)的具体步骤如下：若载体质粒中含有DSRed红色荧光蛋白标记 基因，则采用绿色Led光透过红色太阳镜片照射Ttl代种子，肉眼分辨呈红色荧光的即为转 基因 Ttl代种子；若载体质粒中含有Bar抗草丁膦除草剂标记基因，则可通过对T 植株喷 洒草丁膦除草剂，能够正常生长的初步判定为转基因植株，由此进行初筛；或者，选择其他 的标记基因，根据载体质粒所含的标记基因的不同选择不同的筛选方法。
[0027] 而且，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。
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