黄花蒿冰片脱氢酶基因AaBDH1及其编码蛋白与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种黄花蒿冰片脱氢酶基因 AaBDHl及 其编码蛋白与应用。
【背景技术】
[0002] 黄花蒿（Artemisia annua L.)又名臭蒿，为菊科（Asteraceae)蒿属（Artemisia) 植物，黄花蒿叶中含有丰富的冰片和樟脑等单萜类化合物。冰片是传统中药，中医认为冰片 味辛苦、微寒，归心、脾、肺经，有开窍醒神、通诸窍等作用。《本草纲目》记载，冰片具有"通诸 窍、散郁火"之功效。在许多中成药中常作为"药引"，以增加其它药物的治疗效果，即中医 所谓的"芳香走窜，引药上行"、"独行则势弱，佐使则有功"。冰片具有通诸窍、去郁火、去翳 明目、消肿止痛的功能，还具有抗菌、抗炎、抗生育、抗心绞痛等作用，还发现具有抗癌活性 等药理作用，并对中枢神经系统能够增加血脑屏障的通透性，因此，冰片在医药制剂上的作 用越来越重要。冰片可抑制或杀灭金黄色葡萄球菌、乙型溶菌性链球菌等5种常见细菌，其 最低抑菌浓度（MIC)为1. 0% -2. 0%，最低杀菌浓度（MBC)为1. 5% -2. 0%。小鼠耳廓肿 胀和大鼠足跖肿胀的抑制实验中，表明龙脑和异龙脑均能显著抑制蛋清所致的大鼠足跖肿 胀。冰片具有促进其它药物透皮吸收的作用，能促进曲安缩松透皮吸收。冰片有利于冠脉 痉挛的防治，可减轻缺血所致的心肌损伤。樟脑是冰片的氧化产物，樟脑具有通关窍、利滞 气、辟秽浊、杀虫止痒、消肿止痛的功效，主治疥癣瘙痒、跌打伤痛、牙痛等症状。樟脑涂于皮 肤有温和的刺激及防腐作用。用力涂擦有发赤作用；轻涂则类似薄荷，有清凉感，此乃由于 刺激冷觉感受器的作用。它还有轻度的局部麻醉作用。对于胃肠道粘膜，樟脑有刺激作用， 使胃部感到温暖及舒适，大量则能产生恶心及呕吐。临床上用樟脑擦剂有镇痛、止痒作用。 口服有驱风作用以及轻微的祛痰作用。樟脑的全身作用主要是兴奋中枢神经系统，对于高 级中枢尤为显著，大量作用于大脑皮层运动区及脑干，引起癫痫样惊厥。一般剂量的樟脑对 呼吸无明显作用，在极度抑制情况下，可看到一些呼吸的兴奋，主要是由于皮下注射时刺激 感受器所引起的反射性兴奋。樟脑制剂曾一度广泛匝用为强心药，但各家报告结果很不一 致，迄无定论。它无洋地黄或肾上腺素样作用，对正常心肌无作用，高浓度反抑制之。在离 体心脏上，只有在造成衰竭时，方见有兴奋作用。对血管运动中极，只有在其机能极度低下 时，方见有兴奋作用，内脏血管收缩而皮肤血管舒张，血压上升。故认为对循环性虚脱或急 性心功能衰竭者有效。随着现代药理研究的不断深入，冰片和樟脑的新的药理功能不断被 发现，具有广阔的应用前景。然而，冰片转化为樟脑的分子机制尚未明确，尤其是黄花蒿中 冰片冰片脱氢酶及其基因尚未报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种黄花蒿冰片脱氢酶基因 AaBDHl，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0004] 本发明的另一目的在于提供上述冰片脱氢酶基因 AaBDHl编码的蛋白，该蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0005] 本发明的冰片脱氢酶基因 AaBDHl是从黄花蒿（Artemisia annua L.)中克隆得到 的一种新的冰片脱氢酶基因（现将该基因命名为AaBDHl)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示，该基因全长为1415bp，分析表明，该序列包含一个完整的编码区885bp，5'非翻译区 (UTR)315bp，3'非翻译区180bp和polyA尾巴35bp，编码294个氨基酸组成的蛋白（冰片 脱氢酶）。由该基因编码的冰片脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。该蛋白的分子 量为分子量31043. 4Da，理论等电点PI 6. 16,含量较丰富的氨基酸：Val (36个，12. 3% )、 Gly(30 个，占 10. 2% )、Ala(24 个、8. 2 % )、Leu(24 个、8. 2 % )、Ser(22 个，占 7. 5 % )、 Asn (21个，占7. 1 % )、Thr (18个，占6. 1 % )，含量比较少的氨基酸是Gln (4个，占1. 4% ) 和皿6以5个，占1.7%)，而不含1'印、？71和5〇6。带负电荷的氨基酸数仏8?+6111)为28，带 正电荷的氨基酸数（Arg+Lys)为25,分子式为C1370H2196N3740424S11原子总数为4375， 其半衰期在体外哺乳动物网织红细胞内为30h，在酵母细胞内大于20h，在大肠杆菌细胞内 大于IOh,不稳定系数为15. 6,表明该蛋白稳定性好。脂肪系数为98.06, Grand average of hydr〇pahicity(GRAVY)亲水性评估为-0. 142。为便于表述，将该冰片脱氢酶命名为 AaBDHl。
[0006] 应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员 可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。因而，本发明冰片脱氢酶基因还包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码AaBDHl的核 苷酸序列。
[0007] 此外，应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的冰片脱氢酶的氨基酸序列 (SEQ ID No. 2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到 所述蛋白的突变序列。因此，本发明冰片脱氢酶还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取 代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与AaBDHl同等活性的由AaBDHl衍生得到的蛋 白质。
[0008] 本发明的又一目的是提供含有冰片脱氢酶基因 AaBDHl的重组表达载体 pET28a(+)-AaBDHl 和基因沉默载体 pHe 11 sgate8-AaBDHl。
[0009] 将本发明的AaBDHl基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的 重组表达载体或抑制本发明基因表达的基因沉默载体，进一步将该重组表达载体或者基因 沉默载体导入适当的宿主细胞中，获得表达本发明AaBDHl的基因工程菌，或者转基因黄花 蒿或组织。
[0010] 在本发明实例中，根据AaBDHl编码区序列设计包含酶切位点的引物，通过RT-PCR 的方法先克隆到T-easy载体上，测序正确后将AaBDHl克隆到原核表达载体pET28的多克 隆位点，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，进行诱导表达，优化条件，获得具有活性的冰片脱氢酶。 实验表明，AaBDHl能够催化冰片形成樟脑。
[0011] 在本发明实例中，根据AaBDHl全长序列设计引物，扩增AaBDHl全长序列中的 300bp-550bp左右的基因片段，通过BP反应连接到pD0NR221构建中间载体，测序正确后将 中间载体与pHellsgate 8通过LR反应获得AaBDHl基因沉默载体pHellsgate8_AaBDHl， 转化农杆菌农杆菌LBA4404,浸染黄花蒿叶片等外植体，获得转基因黄花蒿或组织，其体内 AaBDHl表达水平得以改变，从而调控冰片与樟脑的比例。
[0012] 本发明首次提供了一种冰片脱氢酶基因 AaBDHl序列，其编码蛋白其能够催化冰 片形成樟脑，为体外催化冰片生成樟脑，以及黄花蒿体内调控香精油组分的组成（冰片与 樟脑的比例）提供了一种新的可选择途径。此外，本发明通过原核表达制备重组AaBDHl，克 服了直接从黄花蒿中分离该蛋白的困难，降低了成本。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明候选差异基因的半定量RT-PCR分析图。
[0014] 其中，A :18S rRNA ;B :Mutl ;C :Mut2 ;D :Mut3 ;E :Mut4 ;F :Mut5 ;G :Mut6 ;H ;Mut7 ; I :Mut8 J :Mut9 ;K :MutlO ;W :野生型黄花蒿，M :冰片富集型突变株黄花蒿。
[0015] 图2是本发明PCR产物凝胶电泳图。
[0016] 其中，A :5, -RACE，B :3, -RACE。
[0017] 图3是黄花蒿与其它植物脱氢酶蛋白的氨基酸同源性比较。
[0018] 图4是AaBDHl基因的PCR产物电泳图。
[0019] 其中，P :PCR 产物，M :Marker。
[0020] 图5是AaBDHl基因异源表达载体电泳图。
[0021] 其中，M :Maker，第1-5泳道：菌落PCR产物；第6-10泳道：纯化质粒。
[0022] 图6是AaBDHl异源表达产物SDS-PAGE电泳图。
[0023] 其中，1 :纯化蛋白；2 :粗蛋白，3 :Marker。
[0024] 图7是重组蛋白的酶实验。
[0025] 其中，A = NADP+酶反应产物；B:NAD+酶反应产物；C :2_茨醇标样色谱图；D :樟脑标 样色谱图。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0027] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028] 实施例1、定量蛋白组学分离冰片脱氢酶基因片段
[0029] 从长沙市采集到一株冰片富集型突变体黄花蒿，其叶中冰片的含量（0.85mg/g， DW)约为野生型的15倍，而没有检测到樟脑的存在，而在野生型黄花蒿中含有较高量的樟 脑（0.72mg/g，DW)而冰片的含量却很低。对于其他化合物，在野生型和突变体之间的浓度 没有显著差异。研究还发现在野生型黄花蒿的茎中含有〇. 218mg/g(DW)的樟脑和0. 017mg/ g的冰片，而突变体茎含有〇. 28mg/g(DW)的冰片，无樟脑存在。突变体材料的获得为冰片 脱氢酶基因的克隆奠定了坚实基础。以此突变体黄花蒿为材料，通过定量蛋白组学技术 (iTRAQ)分离差异蛋白。具体方法为：取黄花蒿芽头2g，在液氮中冷冻3min，研磨成细粉末， 将样品转移到EP管中，悬浮于4°C预冷的含有Tris-HCl (50mM，pH为8.0)、1 % SDS和5mM EDTA的裂解缓冲液中，涡旋后在3000rmp下离心15min，将上清液转移到新EP管中，并在 12000rmp下进一步离心30min，将上清液再次转移到新的EP管中，并浓缩，加入6BV-20°C 预冷的丙酮，在-20°C下温育2. 5h，并在3000rmp离心IOmin,去丙酮。将沉淀重新悬浮在 0.5M含有0.1