一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用

文档序号:8294141阅读:823来源:国知局
一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学领域,尤其涉及一种新型三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)受体以及利用受体蛋白抗体进行对SCRV病毒感染的防治。
【背景技术】
[0002]三捷梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海洋经济动物,肉味鲜美、营养丰富,深受广大消费者的青睐,也是重要的出口创汇品种。目前三疣梭子蟹是世界上养殖规模最大的海洋经济蟹类。近年来,秋冬季节常出现由梭子蟹呼肠孤病毒引起的疫病使梭子蟹大量死亡的现象,给养殖产业带来重要的经济损失。所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒的毒株为R1015株,保藏号为CGMCC N0.5379,于2011年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(类)呼肠孤病毒是中华绒螯蟹(Er1cheirsinensi)、据缘青蟹(Scylla serrata)和三统梭子蟹(Portunus trituberculatus)的重要病原,哺乳动物呼肠孤病毒受体研宄较系统深入而蟹类呼肠孤病毒受体研宄尚未被报道。
[0003]由于病毒受体及病毒与受体间的互作是病毒感染的关键点而受到广泛的重视从而成为研发热点,已有众多人、畜、禽病毒的细胞受体被阐明,而水生动物病毒受体研宄远落后于人、畜、禽病毒。主要的报道有牙鲆淋巴囊肿病毒、WSSV和海洋双RNA病毒Marinebirnavirus (MABV)。水生生物呼肠孤病毒与细胞受体互作方面,寥有的几篇报道主要是关于草鱼呼肠孤病毒的。通过对三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的研宄对预防及控制该病毒提供有效策略。
[0004]病毒受体的研宄方法比较多,如从基因水平上入手的方法有酵母双杂交技术、克隆表达技术、噬菌体展示技术等。从蛋白质水平入手的方法,如病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)、免疫共沉淀技术等,这些方法的优点是直接、客观。目前,国内外还没有公开任何关于三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及该受体的阻断抑制剂的相关研宄报道。

【发明内容】

[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体,同时利用该受体蛋白免疫小鼠所得到的抗体作为受体阻断剂,该阻断剂对三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染细胞有抑制活性,可以开发防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染的药物。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体,所述的受体为微管蛋白。
[0007]上述三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体的筛选方法,具体步骤如下:
(I)将健康的三疣梭子蟹冰上解剖取其鳃,按质量体积比Ig: (5 - 10)ml加入到预先冰浴过的含有ImM苯甲基磺酰氟的膜蛋白提取液中匀浆,将匀浆液于4°C,600g离心3min,取上清液于4°C,6000g离心5min后,再取上清液于4°C,35000g离心2h,将得到的沉淀用膜蛋白提取液重悬,即得到三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液; (2)将三疣梭子蟹鳃膜蛋白提取液进行8 % SDS-PAGE电泳后,在电转液中将凝胶上所有蛋白条带转移至PVDF膜上,300mA, 4°C转移3h,转移结束后,将PVDF膜从电转槽中取出,用去离子水与PBST缓冲液稍加漂洗后,浸没于20-25ml封闭液中,40r/min室温摇动封闭过夜,将封闭过夜的PVDF膜用PBST缓冲液洗3次,每次5min,将洗涤后的PVDF膜放入塑料袋中,加lmL12.9ug/ml三疣梭子蟹呼肠孤病毒,用封口机封住,室温摇动孵育Ih后,用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次,每次5min ;然后将PVDF膜置于鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液中,在室温下摇动孵育2h,再用PBST缓冲液洗涤3次,每次5min ;再将PVDF膜置于HRP-羊抗鸡二抗稀释液中,在室温下缓慢摇动孵育lh,再用PBST缓冲液洗涤3次,每次1min后,将PVDF膜用PBS缓冲液洗5min后,用邻苯二胺在37°C下避光显色15min,PVDF膜上显色的蛋白条带为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体。
[0008]步骤⑴中所述的膜蛋白提取液的配制方法如下:pH 8.0的lmol/L Tris-HCl100ml、MgCl2.6Η20 0.4063g、0.lmol/L EDTA 10ml,TritonX-100 2ml,补足双蒸水至 1L,高压灭菌。
[0009]步骤(2)中所述的电转液配制方法为:Tris 3g、甘氨酸14.4g,甲醇200ml,补足双蒸水至IL ;所述的封闭液为含5wt%脱脂牛奶的PBST缓冲液;所述的鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗稀释液为鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗用含0.5wt%脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释1000倍所得;所述的HRP-羊抗鸡二抗稀释液为HRP-羊抗鸡二抗用含0.5wt%脱脂牛奶的PBST缓冲液稀释5000倍所得。
[0010]所述的PBST 缓冲液配制方法如下:NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、KH2PO40.2g,500 μ L吐温_20,补足双蒸水至1L,调节pH至7.4,高压灭菌;所述的PBS缓冲液配制方法如下:NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g、KH2PO40.2g,补足双蒸水至 1L,调节pH至7.4,高压灭菌。
[0011]步骤(2)中所述的鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗的制备:取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象,将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏完全佐剂等体积混合,充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫,每只母鸡免疫剂量为500-800 μ g/mL,15-20天后,将三疣梭子蟹呼肠孤病毒抗原和弗氏不完全佐剂进行等体积混合,充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫,每只母鸡免疫剂量为400-600 μ g/mL,加强免疫重复进行三次,每次间隔时间为7-10天,进行三次免疫后收集鸡蛋测定效价,当卵黄抗体效价>1:20000时收集鸡蛋,分离卵黄,用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体。卵黄抗体的纯化的具体方法如下:称取适量卵黄,按1:9加入乙酸-乙酸钠缓冲液(0.05M,PH5.0),搅拌均匀后4°C静置过夜,8000g离心20min,取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40%,4°C搅拌6h,1000g离心20min,沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬,加入饱和硫酸钠至饱和度为40%,4°C搅拌过夜,1000g离心20min,取沉淀用少量PBS溶液(0.01M,PH7.4)重悬,在PBS溶液中透析过夜,即得到鸡抗三疣梭子蟹呼肠孤病毒一抗,于_80°C保存备用。
[0012]所述的微管蛋白在制备用于阻断SCRV病毒感染细胞的受体阻断剂方面的用途。
[0013]所述的受体阻断剂为三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体,其具体制备方法如下: 所述的微管蛋白用0.9%氯化钠悬浮,将微管蛋白和弗氏完全佐剂等体积混合,充分乳化后对小鼠皮下注射进行基础免疫,每只小鼠免疫剂量为10-20 μ g/mL, 15天后,将微管蛋白和弗氏不完全佐剂进行等体积混合,充分乳化后对小鼠皮下注射进行加强免疫,每只小鼠免疫剂量为8-15 μ g/mL,加强免疫重复进行3次,每次间隔时间为7_10天,最后一次免疫后,对小鼠进行摘眼球取血,将血液室温下放置lh,转移至4°C静置3-5h,用针头轻轻将血拨弄后,于4°C,3000g离心lOmin,取血清,即得到三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体,于-80°C保存备用。
[0014]所述的三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体抗体用于开发成防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染方面的应用。
[0015]与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明首次公开了一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体及其筛选方法和应用,利用该受体蛋白免疫小鼠所得到的抗体作为受体阻断剂,该阻断剂对三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染细胞有抑制活性,可以开发防治三疣梭子蟹呼肠孤病毒感染的药物,从而为三疣梭子蟹呼肠孤病毒的研宄和防治提供了一个全新的思路,扩大了研宄的范围,对于实际生产有着极为重要的意义。
【附图说明】
[0016]图1为用Mascot软件进行三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体蛋白质指纹质谱分析,横坐标表示蛋白质分数,纵坐标表示点击次数;
图2为三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)与SCRV受体的结合的免疫共沉淀结果图;
图3为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中的阴性对照,PBS组;
图4为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中抗受体抗体稀释10倍组;
图5为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中抗受体抗体稀释20倍组;
图6为体外三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体阻断试验中抗受体抗体稀释40倍组。
【具体实施方式】
[0017]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0018]具体实施例一
用蛋白印迹技术筛选三疣梭子蟹呼肠孤病毒受体 1、三疣梭子蟹呼肠孤病毒(SCRV)纯化
取攻毒感染死亡的三疣梭子蟹,冰上解剖取其内脏,称量,按质量体积比Ig:(5-20)ml加入到预先冰浴过的含有ImM苯甲基磺酰氟(PMSF)的TNEgl冲溶液中匀浆,将匀浆液于40C,8000g离心20min,沉淀用含ImM PMSF的TNEgl冲液重新悬浮匀浆后再次于4°C,8000g离心20min,合并两次离心所得上清液,将上清液于4°C,6000g离心1min后,取上清液于40C,38000g离心1.5h,用预冷的TM2缓冲液洗去沉淀上层疏松部分,取下层结实白色沉
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