用萃取反萃分离纯化楸树内生真菌发酵液中楸灵素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学领域，涉及一种从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法及其应用，具体涉及一种用萃取反萃分离纯化楸树内生真菌发酵液中楸灵素的方法。
【背景技术】
[0002]内生真菌是指那些生活在于植物组织内部并不会使植物产生明显病害的真菌。内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质，具有巨大的潜在价值，可以成为新型抗癌药物的来源。本课题组已从胡桃楸里分离提取了一株具有很强抗癌活力的内生真菌(CCTCC M 208102)，初步鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属，其发酵提取液对肝癌细胞有很强的抑制作用。这是一个本实验室独有的全新菌种，其具有抗癌能力的发酵液制备方法已经获得专利保护(ZL200810041214.8)。由于发酵液中同时存在大量培养基成分残留和发酵产物等杂质，造成发酵液中生物活性成分楸灵素的纯度较低。需要开发一种低成本的从发酵液中初步纯化楸灵素的方案，才能和后续的楸灵素精细分离方案一起构成经济高效的楸灵素分离纯化技术路线。
[0003]针对上述技术问题，本发明充分利用楸灵素的弱酸性特质，在不同pH环境下调节其电离平衡，从而调节楸灵素的疏水性，采用乙酸乙酯为油相建立萃取反萃工艺，对楸树内生真菌发酵液中的楸灵素进行分离纯化，将楸灵素的纯度提高10倍以上，能大幅度改善后续的楸灵素精细分离过程，是高效分离纯化楸灵素的基础和关键技术。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种用萃取反萃分离纯化楸树内生真菌发酵液中楸灵素的方法，所述方法是一种采用不同PH下乙酸乙酯萃取和反萃过程从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法，该方法不仅可以实现楸灵素的浓缩分离，也可用于其他弱酸性物质的浓缩分离。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]第一方面，本发明涉及一种从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]步骤一、调整楸树内生真菌发酵液pH为4?6 ;
[0008]步骤二、用稀酸溶液预饱和处理乙酸乙酯，使得乙酸乙酯的pH和所述发酵液匹配；
[0009]步骤三、将所述步骤一所述楸树内生真菌发酵液与经步骤二所得乙酸乙酯混匀，静置进行双液相萃取，收集乙酸乙酯相；
[0010]步骤四、将所述收集到的乙酸乙酯相和pH为7?11水相混匀，进行反萃取，回收水相即为纯化的楸灵素水溶液。
[0011]优选地，所述楸树内生真菌发酵液按照专利ZL200810041214.8所述方法制备。
[0012]优选地，步骤一中，所述楸树内生真菌发酵液的pH为4.5?5.5。
[0013]优选地，步骤二中，所述稀酸溶液为稀盐酸溶液；进一步地，所述稀酸溶液为PH4?6的稀盐酸水溶液。
[0014]优选地，步骤二中，所述预饱和处理过程中，预饱和处理的次数大于等于1，每次预饱和处理的时间为30min。
[0015]优选地，步骤二中，所述匹配包括相等或相近。
[0016]优选地，步骤四中，所述水相的pH为8?10。
[0017]优选地，步骤四中，所述反萃取过程中持续加入碱液维持pH恒定。
[0018]优选地，所述水相和碱液中调节pH的有效组分为氨水。
[0019]步骤三中楸树内生真菌发酵液与乙酸乙酯的体积比、步骤四中乙酸乙酯相与水相的体积比均可根据技术人员实际需求而定；提高步骤三中乙酸乙酯相用量可以提高楸灵素收率，减低其纯化选择性；降低步骤四中新碱水用量可以最大限度提高楸灵素的浓缩比，但引起楸灵素收率轻微下降。
[0020]第二方面，本发明涉及一种从楸树内生真菌发酵液中分离纯化楸灵素的方法的应用，所述应用具体为，用于溶液中溶质的浓缩、分离。
[0021 ] 优选地，所述溶液的溶剂包括水。
[0022]本发明所述乙酸乙酯萃取反萃分离纯化楸灵素的原理如下:楸灵素作为一种弱酸性物质，在水溶液中部分电离产生带正电的氢离子和带负电的楸灵素酸根离子，形成电离平衡。因此水溶液中楸灵素有两种存在形式，相对疏水的不带电的楸灵素分子形式和相对亲水的带负电的楸灵素酸根离子形式。调节水溶液的酸碱性可以影响楸灵素电离平衡，从而调节楸灵素在疏水性分子状态和亲水性负离子状态间的分布。
[0023]在酸性条件下，不利于楸灵素电离，楸灵素电离程度降低，主要以疏水性分子状态存在，因此在和乙酸乙酯进行双液相萃取时倾向于从发酵液水相进入乙酸乙酯油相。而亲水性杂质则保留在发酵液水相而被分离去除。
[0024]而在碱性条件下，利于楸灵素电离，楸灵素电离程度提高，主要以亲水的酸根负离子形式存在，因此含有楸灵素的乙酸乙酯在和碱水进行反萃取时，楸灵素倾向于从乙酸乙酯相进入新的碱水相，而疏水性杂质则保留在乙酸乙酯相而被去除。
[0025]因此通过乙酸乙酯的酸性萃取和碱性反萃过程，可以分离去除楸树内生真菌发酵液中绝大多数亲水和疏水性杂质，大幅度提高楸灵素的纯度。
[0026]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:
[0027](I)本发明所述方法分离纯化能力高，可将楸灵素的纯度提高10倍以上，并且所需时间短，无需持续加热，操作过程安全；
[0028](2)本发明方法的所有操作都在室温下操作完成，保证了楸灵素的稳定；
[0029](3)本发明所述方法收率高，活性成分楸灵素的收率可以达到80%以上；
[0030](4)本发明采用物理方法，通过乙酸乙酯萃取反萃实现发酵液中楸灵素的分离纯化，整个操作过程中只是用乙酸乙酯一种有机溶剂，并可通过悬蒸实现乙酸乙酯的回收和重复利用，有效降低成本，防止有机溶剂造成的环境污染。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0032]下述实施例中楸树内生真菌发酵液的制备包括如下步骤:
[0033]一、内生真菌的分离:分裂内生真菌并且采用菌丝尖端切割法进行纯化；
[0034]二、诱导孢子产生:将长枝木霉CCTCC M 208102接种到PDA培养基上，将长有菌丝的PDA培养基切下一块，放于CMX培养基上，室温下培养，I到3天后有孢子长出；
[0035]三、液体发酵培养:挑取孢子转接到装有PDA液体培养基中，26?28°C，180rpm摇床震荡培养，I?8天后终止发酵，即得。
[0036]实施例1
[0037]本实施例涉及一种楸树内生真菌发酵液浓缩分离楸灵素的方法，包括如下步骤:
[0038](I)调整I升发酵液pH为4 ;
[0039](2)用I升pH为4的稀盐酸水溶液对I升乙酸乙酯平衡30分钟，去除水溶液后再次加入I升新的pH为4的稀盐酸水溶液对乙酸乙酯进行饱和平衡，反复进行3次酸水预饱和处理，检测发现平衡后水相PH为4 ;
[0040](3)将前面两步中pH = 4对的发酵液和乙酸乙酯混合，震荡混匀10分钟，然后静置半小时出现清晰的相界面。
[0041](4)去除萃余水相后，加入I升新的pH = 11的水相，震荡混匀10分钟进行反萃取，然后静置半小时出现清晰的相界面。在反萃取和静置过程持续加入少量稀氨水将反萃取体系的pH保持在11。
[0042](5)收集pHll的水相，就是分离纯化后的楸灵素水溶液。
[0043]分别取楸树内生真菌发酵液和萃取后获得的楸灵素水溶液各I毫升，通过HPLC方法检测其中的楸灵素浓度，计算获得乙酸乙酯萃取反萃过程楸灵素的收率为85%。分别取楸树内生真菌发酵液和萃取后获得的楸灵素水溶液10毫升，通过冷冻干燥去除水分到恒重，称重发现固形物重量分别为50.4毫克和4.2毫克，计算可得乙酸乙酯萃取反萃后楸灵素纯度提高到发酵原料液的10.2倍。
[0044]本实施例方法分离纯化前后楸灵素的浓缩比为1，收率为85%，分离纯化后楸灵素纯度提高到楸树内生真菌发酵原料液的10.2倍。
[0045]实施例2
[0046]本实施例涉及一种楸树内生真菌发酵液浓缩分离楸灵素的方法，包括如下步骤:
[0047](I)调整I升发酵液pH为4.5 ;
[0048](2)用0.5升pH为4.5的稀盐酸水溶液对0.5升乙酸乙酯平衡30分钟，去除水溶液后再次加入0.5升新的pH为4.5的稀盐酸水溶液对乙酸乙酯进行饱和平衡，反复进行3次酸水预饱和处理，检测发现平衡后水相PH为4.5 ;
[0049](3)将前面两步中pH = 4.5对的发酵液和乙酸乙酯混合，震荡混匀10分钟，然后静置半小时出现清晰的相界面；
[0050](4)去除萃余水相后，加入I升新