用于灭活病毒以及其他外源性因子的方法
【专利说明】用于灭活病毒以及其他外源性因子的方法
[0001] 相关申请的交互引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请号13/844,051和2012年6月 20日提交的美国临时专利申请号61/662, 349的优先权，将所述专利以其整体并入本文作 为参考。 发明领域
[0003] 本发明提供了使用高温瞬时（HTST)处理以及调整多种参数以使沉淀物的产生和 沉积减少和/或最小化的病毒灭活方法。
[0004] 发明背景
[0005] 病毒在药物生产工艺中是潜在的污染物，特别是在生物药物来源于哺乳动物细胞 培养物的情况下。病毒污染物的来源可以是用于细胞培养的培养基或者产生目的生物制 品的细胞系。目前在生产工艺期间防止病毒污染生物药物的方法包括用于灭活病毒的高 温瞬时（HTST)细胞培养基处理，所述病毒可能通过原材料引入到细胞培养基中并在培养 过程中扩增（Schleh，M.等人 2009. Biotechnol. Prog. 25(3) :854-860 和 Kiss, R. 2011. PDA J Pharm Sci and Tech. 65:715-729)。已经报道，对于HTST所需的约85°C以上的温度是 有效的病毒灭活方法，其中对于灭活细小病毒，需要约95°C以上的温度，所述细小病毒是已 记录的在细胞培养过程中存在的常见细胞培养病毒污染，并且其抗许多化学和物理灭活剂 (inactivating agent) (Schleh 等人）。
[0006] 尽管在病毒的灭活中已经证实HTST处理是高度有效的，但当进行该处理时，在多 种细胞培养基中会产生沉淀或生成沉淀物。该沉淀导致残渣在HTST系统内的表面上积累 并引起设备结垢，以使其不再能将培养基加热至完全灭活病毒污染物的目标温度。此外，该 沉淀还可能使滤器结垢，该滤器通常在HTST系统的下游使用的用于去除来自培养基的微 生物如细菌的最终处理。该滤器结垢可能导致不能完成细胞培养工艺之前的培养基处理步 骤。在一些实例中，沉淀物还可能影响细胞培养基的性能，并妨碍来自培养的细胞系的生物 药物的高效产生。为了防止沉淀，可以降低温度，但可能会不利地影响成功的病毒灭活。此 夕卜，HTST细胞培养基处理期间的沉淀生成可能导致在生产工艺期间频繁地清洁或维护用于 HTST处理的设备，这显著增加了工艺的成本。因此，在去除或灭活病毒污染物的HTST处理 期间存在防止沉淀生成，并且不会不利地影响该处理的效率的需求。
[0007] 本文中所述的发明通过使用HTST处理，提供在细胞培养基中有效灭活病毒污染 物的方法，从而满足了这些需求，所述HTST处理调整了导致沉淀生成减少或防止沉淀生成 的工艺参数。
[0008] 本文中所引用的全部参考文献，包括专利申请和出版物在此处以其整体并入本文 作为参考。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明通过使用高温瞬时（HTST)处理并调整培养基中多种参数如pH和/或钙和 /或磷酸盐浓度组合，提供了用于灭活细胞培养基中的病毒污染物和/或其他污染物的方 法、工艺、系统和组合物。此外，还提供了减少用于HTST处理的设备和滤器结垢的方法、工 艺、系统和组合物。
[0011] 因此，在一个方面，本发明提供了用于在细胞培养基中灭活病毒或外源性因子 (adventitious agent)，同时使所述培养基维持细胞培养适合性的方法，所述方法包括（a) 将细胞培养基进行高温瞬时（HTST)处理，和（b)调整选自pH、钙水平和磷酸盐水平的一个 或多个参数。
[0012] 在其他方面，本发明提供了用于在细胞培养基中灭活病毒的方法，其包括将细胞 培养基进行高温瞬时（HTST)处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5. 0至约pH6. 9之 间的pH。在另一方面，本发明提供了用于在细胞培养基中灭活病毒的方法，其包括将细胞培 养基进行高温瞬时（HTST)处理，其中培养基在HTST处理期间具有约pH5. 0至约pH7. 2之 间的pH。在一些实施方案中，培养基在HTST处理期间具有约pH5. 3至约pH6. 3之间的pH。 在其他实施方案中，培养基在HTST处理期间具有约pH6. 0的pH。在任一实施方案中，HTST 处理包括将培养基的温度升高至至少约85°C并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒或 可能的病毒。在一些实施方案中，将培养基的温度升高至至少约93°C并持续足够的时间，以 灭活培养基中的病毒或可能的病毒。在一些实施方案中，将培养基的温度升高至至少约95、 97、99、101或103°C并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒或可能的病毒。在一些实施 方案中，在多肽产生阶段之前，在HTST处理期间将培养基的pH降低至约pH5. 0至约pH6. 9 之间。在一些实施方案中，然后使培养基的pH达到约6. 9-7. 2之间，以用于多肽产生阶段。
[0013] 在另一方面，本发明提供了在细胞培养基中灭活病毒的方法，包括在HTST处理期 间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约10mM。在一些实施方案中，在HTST处理期 间将培养基中磷酸盐和钙的总浓度限制至约小于9、8、7、6、5、4、3、2或ImM。在一些实施方 案中，在多肽产生阶段之前，在HTST处理期间将培养基中磷酸盐和钙的总量限制至小于约 10mM。在一些实施方案中，在蛋白质产生阶段，然后将培养基中磷酸盐和钙的总量升高至足 够多肽产生的水平。
[0014] 在另一方面，本发明提供了减少用于HTST处理的设备结垢的方法，该方法包括将 在设备中使用的细胞培养基进行高温瞬时（HTST)处理，其中培养基在HTST处理期间具有 约pH5. 0至约pH6. 9之间的pH。在一些实施方案中，在HTST处理期间，培养基具有约pH5. 3 至约pH6. 3之间的pH。在一些实施方案中，在HTST处理期间，培养基具有约pH6. 0的pH。 在一些实施方案中，污垢包含用于HTST处理的设备上的沉淀。在任意实施方案中，HTST处 理包括将培养基的温度升高至至少约85°C并持续足够的时间，以灭活培养基中的病毒。在 一些实施方案中，将培养基的温度升高至至少约95、97、99、101或103°C并持续足够的时 间，以灭活培养基中的病毒。
[0015] 在另一方面，本发明提供了减少用于HTST处理的设备结垢，以灭活病毒的方法， 该方法包括在HTST处理期间，将设备中使用的培养基中的磷酸盐和钙的总量限制至小于 约10mM。在一些实施方案中，将HTST处理期间，培养基中磷酸盐和钙的总浓度限制至小于 约9、8、7、6、5、4、3、2或ImM。在一些实施方案中，污垢包含用于HTST处理的设备上的沉淀。 在任一实施方案中，病毒选自细小病毒科（parvoviridae)、paramyoxviridae、正粘病毒科 (orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科（bunyaviridae)、弹状病毒科（rhabdoviridae)、呼肠 孤病毒科（reoviridae)、披膜病毒科（togaviridae)、杯状病毒科（caliciviridae)和小 RNA病毒科（picornaviridae)。在任一实施方案中，病毒是有包膜病毒。在任一实施方案 中，病毒是无包膜病毒。
[0016] 附图简述
[0017] 图1是在生产中使用的代表性HTST skid的示意图。
[0018] 图2是描述用沙浴法和HTST处理至102°C目标设定点的加热分布图。轨迹显示 了以分钟表示的加热分布图，其中通过时间和终点的温度描述了每一轨迹的终点（例如， "6. 2, 102"的终点值=在6. 2分钟的终点值为102°C )。
[0019] 图3是在通过沙浴法热处理后，在HTST处理期间已知会沉淀的培养基样品的图。 A)在热处理压力容器中pH 7. 0或pH 6. 4的培养基1和pH 7. 0或pH 6. 7的培养基2的未 离心样品。B)来自经处理的压力容器的pH 7.0或pH 6. 4的培养基1和pH 7.0或pH 6. 7 的培养基2的经离心的整分试样。
[0020] 图4针对与更高水平的经沙浴处理的样品浑浊度相关的参数术语，描述了培养基 制剂（基于培养基4)的分类参数估计。
[0021] 图5是描述沙浴热处理期间，通过浑浊度测量的沉淀响应面的一系列图，该浑浊 度来自基于培养基4制剂的3方面（不同的钙、磷酸盐和pH水平）。每一网格可见的透视 平面部分显示了浑浊度低于5NTU的区域，其与测试的培养基样品中不可见的沉淀相关并 代表了安全操作方案。A)侧视图，显示具有不同浓度的磷酸盐和钙的培养基中的浑浊度测 量。俯视图显示培养基中的浑浊度测量，其中B)具有不同浓度的磷酸盐和钙，C)具有不同 的磷酸盐浓度和pH水平，以及D)不同的钙浓度和pH水平。
[0022] 图6是就已知的和估计的钙和磷酸盐浓度而言，描述位于pH 7. 0的培养基4响应 面上的培养基制剂的图。尽管全部制剂中的其他组成有差异，但钙和磷酸盐浓度与热处理 后可能的沉淀强烈相关。箭头指由于添加了含另外水平的磷酸盐和/或钙的水解产物，培 养基移位到了沉淀方案（precipitation regime)。
[0023] 图7描述了在沙浴系统中四种培养基制剂的平均加热分布图。获取了了五种不同 的温度终点（通过两个数字表示，例如"2. 5, 75. 9" =在2. 5分钟获取样品，产生了 75. 9°C 的平均温度）。右边照片中将在未离心和离心样品中观察到的可见沉淀相关的实心圆或空 心圆重叠。空心圆=在未离心的或离心的样品中通过目测方法没有检测到沉淀。实心圆= 在两个或一个样品中通过目测方法检测到了沉淀。
[0024] 图8是描述获自4种不同培养基制剂的5个不同温度终点样品的浑浊度（NTU)值 的图。浑浊度值大于?8NTU与通过直接目测检查或者离心样品检查鉴定的可见沉淀相关。
[0025] 图9是显示HTST处理后铁（左图）和铜（右图）损耗的一系列图，其中HTST加 工和过滤操作都是成功的。
[0026] 图10是显示在热处理期间，由于改变A)pH水平、B)钙（Ca)浓度、C)磷酸盐（PO4) 浓度、D)铁（Fe)浓度和E)铜（Cu)浓度对铁回收的主效应图。
[0027] 图11描述了显示来自统计学设计实验（实验设计（DoE))结果的相互作用图的一 系列图，所述统计学设计实验结果显示了热处理期间pH、Ca、P0 4之间和Fe对铁回收的互作 效应。
[0028] 图12是显示在经热处理的培养基中，最终Fe浓度对初始Fe浓度的依赖性的图。 全部其他培养基组分都处于正常的I. 5X培养基4水平。
[0029] 图13是显示在经热处理的培养基中，Fe补偿对几种参数的调整的依赖性的图。在 经热处理的培养基中，A)Fe回收对pH水平的依赖性，和B)Fe回收对钙和磷酸盐的浓度的 依赖性。全部其他培养基组分都处于正常的1.5X培养基4水平。在X轴刻度上，培养基 4的标准浓度通过1表示。
[0030] 图14是显示热处理后，钙和磷酸盐回收与Fe回收的关系图。红色圆圈内的数据 点指示显示出可见沉淀和增加的浑浊度（NTU)的样品。直线表示Fe回收与钙数据点的关 系。
[0031] 图15是显示HTST处理前和后，在多种细胞培养基制剂中铁水平的图。对于特定 的细胞培养基（例如，培养基14)，左边的棒状图表示HTST处理后细胞培养基中铁的期望水 平，中间的棒状图表示HTST处理前（HTST前）细胞培养基中铁的实际水平，右边的棒状图 表示HTST处理后（HTST后）细胞培养基中铁的实际水平。
[0032] 图16是显示将铁加入经HTST处理的培养基中在细胞培养中对NSO骨髓瘤细胞系 的生长有益的图。HTST+表示细胞