一种检测羊巴贝斯虫的实时荧光定量pcr试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测动物血液原虫病的引物对及检测试剂盒。确切讲本发明涉及一种用于快速、特异、灵敏的检测绵羊、山羊和传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的引物对和检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]巴贝斯虫病(方S b e s i O S i S)是由媒介蜱传播的巴贝斯属的多种原虫寄生于脊椎动物红细胞内而引起的一种血液原虫病。目前，全世界已报道的巴贝斯虫有100多个种。该病在世界范围内广泛分布，由于某些巴贝斯虫，如田鼠巴贝斯虫(B.microti)和分歧巴贝斯虫(B.divergence)能够感染人，所以也将其划为人兽共患病病原的范畴。对人类健康和畜牧业有重要影响的巴贝斯虫主要有感染牛的牛巴贝斯虫(B.bovis)与双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、感染羊的绵羊巴贝斯虫(B.0vis)与莫氏巴贝斯虫(B.motasi)。感染马属动物的弩巴贝斯虫(B.cabalIi)及能感染人和鼠的田鼠巴贝斯虫和可以感染多种脊椎动物的分歧巴贝斯虫等(Comillot et al., 2012; Levine, 1988; Ristic, 1988)。
[0003]截至目前，已报道的感染羊的巴贝斯虫病病原有5种，即莫氏巴贝斯虫(B.motasi)、绵羊巴贝斯虫(B.0vis)、粗糙巴贝斯虫(B.crass a)、叶状巴贝斯虫(B.f ο I i a t a)和泰氏巴贝斯虫(B.t a y I o r i )。我国对羊巴贝斯虫病的研究起步较晚，最早在四川(I 9 8 2年)和黑龙江(I 9 8 6年)有过相关报道。之后，在云南、山西、河南和甘肃等省份也有零星的报道，但一直没有分离到病原。直到1996年，兰州兽医研究所虫媒与虫媒病实验室长期从事梨形虫的研究工作过程中，先后从河北、辽宁、甘肃、新疆和湖北等地分离到了 9株羊的巴贝斯虫，通过分子分类学和生物学特性研究表明这些巴贝斯虫可以分为两个种群，即莫氏巴贝斯虫种群(B.motasi)和巴贝斯虫未定种种群(Babesia sp.) (Guan et al., 2002, 2009; Liu et al., 2007; Niu et al.,2009)。其中羊巴贝斯虫临潭株、羊巴贝斯虫宁县株、羊巴贝斯虫天祝株、羊巴贝斯虫麻当株和羊巴贝斯虫河北株属于莫氏巴贝斯虫种群；而羊巴贝斯虫新疆株和羊巴贝斯虫敦煌株属于巴贝斯虫未定种(Bai et al., 2002; Guan et al., 2002; Liu et al., 2007b ；Niu et al., 2009a)。同时也建立了各种分子生物学和血清学检测技术，通过流行病学调查显示，在中国，羊巴贝斯虫病感染的阳性率为I 1.2 %?3 1.7 %，在甘肃甘南牧区高达 8 2.3 8 % (Guan et al, 2012)。
[0004]该病在世界各地广泛流行，在我国许多地区也时有发生，尤其是在某些牧区，严重阻碍了畜牧业的发展。因此，建立快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。
[0005]目前常用的诊断方法为血涂片染色法，但在感染率很低或在感染早期时很难在显微镜下检查出病原，而且操作熟练程度将直接影响诊断结果的准确性。还有很多血清学方法，但都存在一定的假阳性或假阴性以及交叉反应。分子生物学诊断方法有套式PCR检测方法，LAMP检测方法(Guan et al., 2010e ；Guan et al, 2012)，但套式PCR检测过程中容易造成环境污染，LAMP检测过程中容易出现假阳性。中国发明专利201310566411.2虽然公开了鼠源巴贝斯虫的检测引物及实时荧光定量PCR试剂盒，从理论上讲可以用类似的方法建立一种用于检测羊的检测引物及实时荧光定量PCR试剂盒，但问题是所建立的引物是否能适用于其他反刍动物感染巴贝斯虫的情况，特别是我国牛、羊巴贝斯虫种类之多，能否专一性的检测到多种或所有的羊巴贝斯虫则是一个难于解决的难于解决的问题。目前我国已报道的牛、羊梨形虫已达15种之多，在流行区内这些梨形虫对哺乳动物宿主和自然媒介蜱常呈混合感染。由于自然界中媒介蜱与宿主的关系非常复杂，且每种病原都能独立的引起疾病，其混合感染和隐性感染的现象比较多。对流行区内放牧羊群和自然界存在媒介蜱感染状况进行调查过程中，如何提高检测的快速性与敏感性和对不同病原进行鉴别诊断是巴贝斯虫流行病学研究的弱点问题。因此建立一种特异性强、专一性的检测我国分布的羊巴贝斯虫的方法已迫在眉睫。
【发明内容】
[0006]本发明提供一种可克服现有技术不足，能对多种羊羊巴贝斯虫进行检测的引物对，及用包括有所述的引物的检测羊巴贝斯虫的实时定量PCR试剂盒。
[0007]本发明的一种用于检测羊巴贝斯虫的引物对核苷酸序列分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。
[0008]本发明的一种用于检测羊巴贝斯虫的实时定量PCR试剂盒包括引物对和探针，其中引物对为:SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，探针核苷酸序列为SEQ ID N0.3，SEQ ID N0.3的5端结合有荧光发光基团FAM，3端结合有荧光猝灭基团BHQl。
[0009]为方便使用，本发明的用于检测羊巴贝斯虫的试剂盒内还有标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18S rRNAOB、阴性质控标准品，荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq?，和荧光校正液 ROX Reference Dye II。
[0010]本发明实际上是一种利用核糖体18S rRNA基因检测绵羊、山羊和传播媒介蜱体内巴贝斯虫的实时荧光定量PCR方法。实时荧光定量PCR( real- time fluorescentquantitative polymerasechain react1n, real-time FQ-PCR)技术于 1996 年由美国Applied B1systems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR技术相比，它具有的特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快和全封闭反应等优点，使其很快成为科研、临床诊断的热点技术。本发明利用梨形虫(巴贝斯虫和泰勒虫)常用来做为鉴别诊断的靶标基因核糖体18S rRNA基因，该基因在梨形虫中高度保守，但在不同虫种之间存在可变区，本发明准确利用该基因的这一特点作为实时荧光定量PCR检测的靶标基因，设计针对绵羊、山羊和蜱体内检测巴贝斯虫的特异性引物和探针，试验表明该引物对与探针只能特异性的检测到感染羊的巴贝斯虫，且灵敏度较高，但未能检测到感染牛的巴贝斯虫和其它相关的病原，其中巴贝斯虫检测组与对照组基本上囊括了国内现存的病原，检测结果良好，从而提供了一种快速、灵敏、准确又操作方便的检测羊巴贝斯虫的方法，填补了技术空白。本发明中，所用的特异性引物和探针虽然是通过莫氏巴贝斯虫临潭株的18S rRNA基因设计的，试验表明，本发明的引物对和探针可适用于分离我国现发现的其它几株感染羊的巴贝斯虫(莫氏巴贝斯虫宁县株、莫氏巴贝斯虫天祝株和莫氏巴贝斯虫河北株，以及最近发现的羊巴贝斯虫未定种新疆株，这一点恰好体现了本发明所选的靶标基因核糖体18S rRNA基因的保守性和可变区的特点，这一优点是其它基因和本发明外的其它引物对无可比拟的，也是在试验中得到的其它引物所不具有的。通过相应的试验，经对实时荧光定量PCR反应条件的优化，使本发明具有良好的特异性、敏感性和重复性，可使本发明广泛适用于绵羊、山羊和传播媒介蜱体内羊巴贝斯虫的快速定量检测。
【附图说明】
[0011]图1实