一种用于检测脂肪酸浓度的方法及其中使用的基因工程大肠杆菌的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种用于检测脂肪酸浓度的方法及其中使用的基 因工程菌。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸是一种重要的化工原料，可以用于丁苯橡胶生产中的乳化剂和其他表面活 性剂、润滑剂、光泽剂；还可用于生产高级香皂。
[0003] 传统的检测脂肪酸的方法为气相色谱法。气象色谱仪器昂贵，需要专门机构才能 使用，而且气象色谱也不能实现实时检测。因此，寻找合适的检测脂肪酸浓度的方法势在必 行。
[0004] FadR是一种在大肠杆菌中存在的蛋白质，他可以和脂酰-CoA结合，从而改变构 象。脂酰-CoA的浓度和脂肪酸浓度正相关。
[0005] PFadI^PPFabB是受到FadR蛋白调控的启动子。调控的方式如图3所示：当没有脂 酰-CoA时，FadR蛋白会抑制启动子PFadD的表达并且同时激活启动子P_的表达；当有较 多脂酰-CoA时，脂酰-CoA与FadR蛋白相结合使之改变构象，可以激活启动子PFadD的表达 并且同时抑制启动子PFabj^表达。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种生物检测脂肪酸浓度的方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供该方法中使用的基因工程菌。
[0008] 本发明的友谊目的是提供该基因工程菌的应用。
[0009] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0010] 一种生物检测脂肪酸浓度的方法，包括以下步骤：
[0011] A)构建共表达由启动子PFadD驱动的RFP基因和外源启动子PFabB驱动的GFP基因 的重组工程大肠杆菌菌株；
[0012] B)将待检测样品加入所述的重组工程大肠杆菌发酵液中发酵培养，检测红色荧光 和绿色荧光强度；
[0013] C)根据红色荧光和绿色荧光的强度确定样品脂肪酸浓度。
[0014] 所述启动子？&(11)来源于大肠杆菌，序列如SEQIDNO. 1所示；所述启动子？^^来 源于大肠杆菌，序列如SEQIDNO. 1所示；所述的GFP基因，序列如SEQIDNO. 3所示；所述 的RFP基因，序列如SEQIDNO. 4所示。
[0015] 所述的重组工程大肠杆菌菌株是将共表达质粒pSBlC3R+G转化到大肠杆菌 DH5a所得；所述的共表达质粒PSB1C3R+G优选以pSBlC3为出发载体，在XbaI/SpeI酶 切位点间依次插入启动子PFadD、RFP基因、启动子PFabB及GFP基因所得。质粒pSBlC3的 XbaI/SpeI酶切位点间的具体情况如图1所示。共表达质粒pSBlC3R+G的构建方法示意 图见图2。
[0016] 步骤B)优选将所述的重组工程大肠杆菌在30-37°C、400-800rpm、pH 6. 5-7. 5 和溶氧20%以上的条件下培养至0D600约为12 -20,加入待检测样品，发酵2-4小时后检 测红色荧光和绿色荧光强度。
[0017] 所述的方法，在激发光波长501nm，发射光波长511nm检测绿色焚光；在激发光波 长584nm，发射光波长607nm检测红色荧光
[0018] 所述的方法还包括构建红色荧光强度、绿色荧光强度与脂肪酸浓度的标准曲线； 将待检测样品的红色荧光强度、绿色荧光强度带入标准荧光曲线，得出待检测样品所含的 脂肪酸浓度。
[0019] -种用于检测脂肪酸含量的PFadD_RFP和PFabB-GFP共表达质粒，该质粒共表达由 启动子PFadD驱动的RFP基因和由启动子PFabB驱动的GFP基因。
[0020] 所述的共表达质粒是以PSB1C3为出发载体，在XbaI/SpeI酶切位点间依次插入 启动子PFadD、RFP基因、启动子PFabB及GFP基因所得。详细构建方法见图2。
[0021] 一种用于检测脂肪酸含量的基因工程菌，由本发明所述的共表达质粒转染大肠杆 菌所得。
[0022] 本发明所述的共表达质粒、所述的基因工程菌在检测脂肪酸浓度中的应用。
[0023] 本发明利用工程大肠杆菌作为生物传感器检测脂肪酸浓度的原理（图3和图4):
[0024] FadR是一种在大肠杆菌中存在的蛋白质，可以和脂酰-CoA结合。PFad#PPFabB是受 到FadR蛋白调控的启动子。调控的方式如图2所示：当没有脂酰-CoA时，FadR蛋白会抑 制启动子PFadD的表达并且同时激活启动子PFalJ^表达；当有较多脂酰-CoA时，脂酰-CoA 与FadR蛋白相结合使之改变构象，可以激活启动子PFadD的表达并且同时抑制启动子PFalJ9 表达。
[0025] 同时，脂酰-CoA的浓度和脂肪酸浓度呈正相关。当脂肪酸浓度较高时，脂酰-CoA 的浓度也会升高，脂酰-CoA与FadR蛋白相结合使之改变构象，激活启动子PFad^^表达并 抑制启动子PFabB的表达，从而使启动子PFadD后面的RFP基因表达，于是"红光亮";当脂肪酸 浓度较低时，脂酰-CoA的浓度也很低，FadR蛋白会抑制启动子PFadD的表达并激活启动子 PFabB的表达，从而使启动子PFabB后面的GFP基因表达，于是"绿光亮"。通过建模建立重组工 程菌的脂肪酸含量与红、绿荧光强度的标准曲线。通过检测待测样品的红、绿荧光强度就能 计算出待测样品中脂肪酸的浓度。
[0026] 有益效果：
[0027] 本发明中的重组菌株能够高效地检测脂肪酸，该检测过程在温和的条件下 (30 - 37°C)即可以进行，该方法为脂肪酸生物的快速检测打下了坚实的基础。
【附图说明】
[0028] 图lPFadD-RFP和PFabB - GFP共表达质粒示意图。
[0029] 图2质粒的连接方法。
[0030] 将目的片段1插人到目的片段2的左侧。首先利用EcoRI和SpeI两个酶切位 点将片段1切割下来；利用EcoRI和XbaI两种酶在含有片段2的质粒上形成一个切口。 之后将两种片段混合，在连接酶的作用下，片段1上的EcoRI位点会与片段2上的EcoRI 位点粘在一起，形成新的EcoRI酶切位点；而片段1和片段2上的同尾酶切位点SpeI和XbaI因留下相同的粘性末端而粘在一起。由此插人片段准确地嵌入载体上的小口中，且融 合后的S/X混合位点不能被XbaI和SpeI识别而切开；与此同时，片段1又将自身的Xba I位点加人到片段2上，实现两个片段的成功连接。
[0031] 图3FadR蛋白调控PFadD和PFabB启动子的示意图。
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