冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒的利记博彩app
【专利说明】冷休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒
[0001] 本申请是申请日为2009年3月2日、申请号为200980106857. 9、发明名称为"冷 休克蛋白质组合物和用于其用途的方法以及试剂盒"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 优先权声明
[0003] 本申请要求提交于2008年2月29日的美国临时申请号61/067, 596,提交于2008 年10月9日的美国临时申请号61/195, 747,以及提交于2008年5月16日的日本申请号 2008-129745的优先权，这些公开的内容在此处全部并入本文作为参考。
[0004] 序列列表
[0005] 随本文一并提交书写形式的及计算机可读形式的序列列表。计算机可读形式记录 的信息与书写形式的序列列表是相同的。
[0006] 发明背景
[0007] 在研究领域，将DNA的合成用于多种目的。其中，除了化学合成短链DNA如寡聚核 苷酸之外，通过使用了DNA聚合酶的酶促方法进行DNA合成中的大部分。PCR可在体外容易 地扩增所需要的核酸片段，有极高的价值，并已经成为生物学、医学、农业和其他领域中不 可缺少的工具。在由PCR扩增DNA的过程中，许多情况下都要求反应的高特异性。尽管开 发了新型DNA聚合酶，也优化了反应混合物的组成以减少非-特异性扩增，但是仍然需要对 PCR扩增特异性的改进。
[0008] 除了使用DNA作为模板材料的传统PCR方法之外，还可使用RNA-依赖的DNA聚合 酶逆转录酶实现DNA的合成。在研究领域中，常常有必要分析衍生自多种基因的mRNA分 子。逆转录酶使得用RNA作为模板合成cDNA的逆转录反应成为可能，并且因此，已经在对 mRNA分子的分析上实现了卓越的进步。通过在克隆技术和PCR技术的应用，其中使用了逆 转录酶的mRNA分子的分析现在在遗传学研究中是不可缺少的实验技术，并且已经成为多 种领域如生物学、医学、农业中绝对必要的技术。
[0009] 迄今已经产生了一些手段以改进逆转录反应的反应性，例如，已经研究了在高温 下进行的逆转录反应过程；在其中使用了逆转录酶以及具有3' -5'外切核酸酶活性的酶的 cDNA合成过程（JP专利号3910015);其中使用了核酸-结合蛋白质如Ncp7、reCA、SSB及 T4gp32的过程（W0 00/55307);等等。尽管有一些对逆转录反应的反应性的改进，然而可能 无法合成全长的cDNA，并且甚至在如今，有些情况下所合成的cDNA的量可能不足。因此，对 逆转录反应的反应性的改进仍然是正进行的大事，必须要进一步改进。
[0010] 除了对上文描述的两种DNA合成方法的改进之外，在科学领域还需要可以确定内 切核糖核酸酶的切割位点特异性的技术。例如，mRNA干扰酶为存在于广泛的细菌基因组中 的毒素_抗毒素系统编码的序列-特异性内切核糖核酸酶。这些内切核糖核酸酶通常具有 单链RNA内的特异性切割位点：大肠杆菌（E.coli)MazF在ACA序列处特异性切割，ChpBK 在ACY序列处（Y为U、A或G)特异性切割，来自质粒R100的PemK在UAH序列处（其中H 为C、A或U)特异性切割，来自结核分枝杆菌（M.tuberculosis)的MazF-mtl和MazF_mt6 分别在UAC和U富含区域特异性切割。最近，有发现来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的MazF同源物在VUUV'处进行切割（其中V和V'为A、C或G，且可以相同或不相 同）。然而确定分支结核杆菌的一些MazF同源物的切割特异性的之前尝试却失败了。尤其 是对于确定其中识别长于三个碱基的特异性序列的切割特异性，使用足够长以覆盖所有可 能的靶标序列的RNA底物是至关重要的。使用长RNA作为底物的一个主要问题在于尽管其 为单链RNA，却形成非常稳定的二级结构。为了使用这种或任何其他长RNA作为内切核糖 核酸酶的底物，必须解折叠其二级结构。因此，还有对开发用以确定内切核糖核酸酶如mRNA 干扰酶的切割-位点特异性的新技术的需要。
[0011] 在多种微生物体内发现有冷休克蛋白质，人们认为其在对生长温度下移的适 应中起到一些作用。其中，已经鉴定CspA为一种主要的冷休克蛋白质。从大肠杆菌 (Escherichiacoli)中分离出编码CspA的基因，并使用其基因产生了重组CspA(见TO 90/09444)。然而，冷休克蛋白质的常规提出的应用限于其作为冷冻保护蛋白质的用途，其 保护农田中不受冷冻或霜冻损害。
[0012] 本发明提供了用于改进的DNA合成反应（具有改进的反应性）的包含冷休克蛋白 质的组合物，使用这些组合物用于合成DNA的方法，在这些方法中使用的试剂盒，以及通过 这些方法产生的组合物。本发明进一步提供用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的包含冷休 克蛋白质的组合物，使用这些组合物用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法，以及在这 些方法中使用的试剂盒。
[0013] 发明概述
[0014] 根据本发明，提供了使用DNA聚合酶用于DNA合成的组合物，使用这种组合物用于 合成DNA的方法，用于这种DNA合成方法的试剂盒，以及根据所提供这种方法合成的DNA组 合物。本发明的一个目标是使得使用DNA聚合酶进行DNA合成成为可能，其中反应的反应 性得到改进。
[0015] 本发明的一个实施方式涉及用于DNA合成的组合物，其包含冷休克蛋白质和DNA 聚合酶。在本发明的特定实施方式中，作为此冷休克蛋白质的示例为CspA或其同源物，优 选地，为衍生自大肠杆菌的CspA或其同源物。组合物可包含超过0. 5yg的CspA每25yL 组合物。根据这种实施方式的组合物可包含两种或多种DNA聚合酶。进一步地，根据这种 实施方式的组合物可包含至少一种引物和至少一种脱氧核苷酸。这种组合物可进一步包 括液体媒介物，如反应缓冲溶液。
[0016] 本发明的一个进一步的实施方式包含A)冷休克蛋白质；B)至少一种选自DNA聚 合酶、引物、脱氧核苷酸、和DNA的组分；以及C)液体媒介物。
[0017] 本发明的一个进一步的实施方式涉及合成DNA的方法，其包括步骤:A)制备包含 冷休克蛋白质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷三磷酸、和DNA的混合物；以 及B)孵育步骤A)中制备的混合物。
[0018] 本发明的另一个实施方式涉及用于DNA合成的试剂盒，其包含冷休克蛋白质和 DNA聚合酶。根据这种实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物或关于如何使用试剂盒 的纸质或电子形式的说明书。这种试剂盒的组分可单独地或分开地存在。
[0019] 本发明还涉及由包括以下步骤的方法合成的DNA组合物：A)制备包含冷休克蛋白 质、DNA聚合酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷的混合物、和DNA;以及B)孵育步骤A)中 制备的混合物。
[0020] 本发明还涉及有利地用于逆转录反应的组合物，使用所述组合物的CDNA合成方 法，有利地用于逆转录反应的试剂盒，以及由此方法合成的cDNA组合物。根据本发明，可实 现这种令人满意的逆转录反应，其在特异性、合成链的长度、合成量等等方面是出众的。 [0021] 本发明的一个实施方式涉及用于逆转录反应的组合物，其包含冷休克蛋白质或其 同源物；和逆转录酶。在根据本发明的这种实施方式中，冷休克蛋白质的实例是CspA或其 同源物，CspA的一个实例为衍生自大肠杆菌的CspA。在一些实施方式中，CspA可以从大约 0. 5yg-大约20ygCspA每20yL的组合物的量存在。逆转录酶的实例为衍生自莫洛尼鼠 类白血病病毒的逆转录酶和/或衍生自禽成髓细胞瘤病毒的逆转录病毒的逆转录酶和/或 其组合。进一步地，根据本发明的此实施方式中的组合物可进一步包含至少一种引物和至 少一种脱氧核苷酸。组合物的进一步的实施方式包含液体媒介物，如反应缓冲溶液。其他 实施方式包含寡聚（dT)引物或具有随机序列的寡聚核苷酸引物或其组合。
[0022] 本发明的一个进一步的实施方式包含用于逆转录反应的组合物，其包含：A)冷休 克蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、脱氧核苷酸、和RNA的组分；以及C)液体媒介 物。
[0023] 本发明的一个进一步的实施方式涉及用于合成cDNA的方法，包括:A)制备包含冷 休克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷、和RNA的混合物；以及B)孵育步 骤A)中制备的混合物。
[0024] 本发明的一个进一步的实施方式包含用于逆转录反应的试剂盒，包含：A)冷休克 蛋白质；B)至少一种选自逆转录酶、引物、脱氧核苷酸、和RNA的组分；以及C)液体媒介物。 根据这个实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物或关于如何使用试剂盒的纸质或电 子形式的说明书。这种试剂盒的组分可单独地或分开地存在。这个实施方式的试剂盒可进 一步包含用于进行基因扩增反应的试剂。
[0025] 本发明进一步涉及由包括以下步骤的方法合成的cDNA组合物：A)制备包含冷休 克蛋白质、逆转录酶、至少一种引物、至少一种脱氧核苷、和RNA的溶液；以及B)孵育步骤 A)中制备的溶液。
[0026] 本发明进一步涉及用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的组合物，使用这些组合物 用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的方法以及用于这些方法的试剂盒。
[0027] 本发明的一个实施方式涉及用于鉴定内切核糖核酸酶切割位点的组合物，A)冷休 克蛋白质；以及B)至少一种选自RNA底物和内切核糖核酸酶的组分。在根据本发明的这种 实施方式中，冷休克蛋白质的实例为CspA或其同源物，CspA的一个实例是衍生自大肠杆菌 的CspA。在优选的实施方式中，RNA底物长于1024个碱基并含有大约相等数量的每种碱 基。这种RNA底物的一个实例为细菌噬菌体MS2RNA。这种实施方式的组合物可进一步包含 液体媒介物。
[0028] 本发明的另一个实施方式涉及用于确定内切核糖核酸酶切割位点的方法，其包括 步骤:A)制备包含冷休克蛋白质、RNA底物、和内切核糖核酸酶的混合物；以及B)孵育步 骤A)中制备的混合物。这种方法可进一步包括通过电泳分析混合物。
[0029] 本发明的一个进一步的实施方式涉及用于确定内切核糖核酸酶切割位点的试剂 盒，其包含冷休克蛋白质和RNA底物。此实施方式的试剂盒可进一步包含液体媒介物，如反 应缓冲溶液。
[0030] 此实施方式可进一步包含关于如何使用试剂盒的纸质或电子形式的说明书。在这 种实施方式中，冷休克蛋白质和RNA底物可单独或组合存在。
[0031] 如本文使用的，冷休克蛋白质为那些在暴露于生长温度下移引起的冷休克时在生 物体，尤其是微生物体中表达的蛋白质的集体名称。当大肠杆菌的孵育温度从37°C降低到 15°C时，会高水平地瞬时表达叫做CspA的冷休克蛋白质。已知大肠杆菌有八种不同的蛋 白质，CspB-CspI，其与CspA具有高的氨基酸序列同一性。在这些蛋白质中，CspB、CspG和 CspI为冷休克蛋白质。进一步地，通常已知这些冷休克蛋白质的同源物存在于其他微生物 如枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)(CspB)、热溶芽抱杆菌（Bacilluscaldolyticus) (CspB)、海栖热袍菌（Thermotogamaritima) (CspB，CspL)和胚芽乳杆菌（Lactobacillus plantarum) (CspL)。在本发明中，CspA的同源物指的是具有显示与衍生自大肠杆菌的CspA 的氨基酸序列至少50%的序列同一性的氨基酸序列的冷休克蛋白质。在本发明中，可使用 这些冷休克蛋白质。在本发明中使用的冷休克蛋白质的实例优选地为CspA，更优选地是衍 生自革兰氏-阴性细菌的CspA，甚至更优选地是衍生自大肠杆菌的CspA。可通过重组DNA 技术或从微生物体中分离而制备本发明中使用的CspA。
[0032] 同源物指的是与目标蛋白质具有序列同源性的实体，优选地显示与另一种多肽的 氨基酸序列有至少50%的序列同一性，并且在结构特征或生物学功能上具有相似性。
[0033] 如本文使用的，脱氧核苷酸指的是通过磷酯键键合于脱氧核糖的磷酸基团，所述 脱氧核糖键合于有机碱基。天然DNA包括四种不同的核苷酸。这些核苷酸分别由可在天 然DNA中找到的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶碱基构成。腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸 腺嘧啶碱基分别缩写为A、G、C和T。脱氧核苷酸包括游离的单磷酸、二磷酸和三磷酸（更 具体地，磷酸基团的每种包含一个、两个或三个磷酸部分）。因此，脱氧核苷酸包括脱氧核 苷酸三磷酸（例如，dATP、dCTP、dITP、dGTP和dTTP)及其衍生物。脱氧核苷酸衍生物包括 [aS]dATP、7-deaza-dGTP、7-deaza-dATP以及显示出针对核酸分解的抗性的脱氧核苷酸衍 生物。脱氧核苷酸衍生物包括例如，以这样的方式标记的脱氧核苷