一种抑制胶质瘤生长的过表达bdnf的间充质干细胞的制备方法及其临床应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的方法以及 通过所述方法获得过表达BDNF的间充质干细胞，特别地，本发明涉及的过表达BDNF的间充 质干细胞体外实验中启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124的表达，抑制miR-124靶基因 STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力，体内实验中抑 制了胶质瘤的生长和转移；本发明的过表达BDNF的间充质干细胞可以用于临床治疗胶质 瘤，针对性地抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细 胞的目的。
【背景技术】
[0002] 胶质瘤的发病是一个多因素、多步骤的、多种癌基因和/或抑癌基因参与的协同 积累的过程。迄今为止，传统的手术、放疗、化疗等治疗方法治愈率仍然很低，肿瘤复发率 高，预后极差。传统的胶质瘤治疗主要作用于肿瘤的实体，其疗效有限，胶质瘤本身的复 发转移的能力使得手术后肿瘤再次生长和转移。原因是肿瘤本质上具有抵抗化学疗法和 放射治疗的能力或在治疗过程中获得此种能力。而执行这一能力的可能是胶质瘤干细胞 (Glioma stem cells，GSC)，其中的机制包括自噬作用、环氧化酶-2依赖的炎症反应、抑制 凋亡、ATP结合转运蛋白的外排功能、Notch信号通路介导作用、DNA损伤修复反应。
[0003] 针对胶质瘤干细胞靶向治疗目前研发一些治疗手段，如通过靶向GSC杀伤可以逆 转肿瘤放化疗抵抗，提高放化疗的敏感性；针对血管或内皮细胞的抗血管微环境的治疗，均 能干扰肿瘤干细胞微环境的功能，在抑制肿瘤生长的同时还消弱了肿瘤的根本；可以识别 和清除GSCs的免疫细胞治疗，也为抗胶质瘤治疗提供新的思路。
[0004] 本发明提供了一种在胶质瘤中低表达的微小核糖核酸124 (microRNA-124， miR-124)，造成胶质瘤干细胞增殖和成球生长，使得胶质瘤生长和转移复发。然而，提 高miR-124在胶质瘤中的表达，抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，引起胶质瘤缩 小和抑制转移与复发。本发明以人间充质干细胞作为载体过表达脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，能有效地启动胶质瘤干细胞中 miR-124 的 表达，从而抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，抑制胶质瘤的生长与转移复发。人间充 质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产，是 基因表达理想的载体，因而，本发明抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞制备简 单，能个体化临床治疗胶质瘤患者，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗胶质瘤。
【发明内容】
[0005] 胶质母细胞瘤高度不均一性，分为三个等级，最高级的是肿瘤干细胞，位于塔顶， 接下来是分化阶段的肿瘤祖细胞，位于塔底的是已分化的大量肿瘤细胞。现在的治疗往往 针对的是肿瘤实体中的分化细胞，而忽视了前两种细胞，虽然这些干细胞只占胶质母细胞 瘤的很小一部分，但很可能负责肿瘤的起源和生长，侵袭和复发及远处播散。胶质瘤干细胞 具有下列特性：自我更新、无限增殖、多向分化潜能、表达神经干细胞的标志物、培养于干细 胞培养基中能形成细胞球、极小数量接种于免疫缺陷小鼠颅内能独立成瘤。GSCs的起源至 今未明，可能来源于遗传或表观遗传突变的神经干细胞或祖细胞，或者星形胶质细胞经过 一系列的突变或重新编程而来。GSCs比一般细胞对放射治疗和化学治疗更加耐受。GSCs的 这些特性被视为是胶质母细胞瘤恶性表型和术后复发的根源，GSCs是胶质母细胞瘤的"种 子细胞"，针对GSCs的研宄或治疗更能模拟胶质母细胞瘤的真实情况，可见GSCs已成为研 宄治疗脑胶质母细胞瘤的新工具。
[0006] 本发明是我们长期通过基础研宄的科研成果，发现miR-124在胶质瘤发生发展中 发挥着重要作用，是胶质瘤干细胞赖以生存的抑制分子。我们研宄发现miR-124可通过靶 向多个基因，包括白介素6(interleukin 6，IL-6)信号通路中的一个已知兀件信号传导与 转录激活因子 3 (Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)，白介 素1 (IL-1)信号通路中的一个已知元件核因子-kB (nuclear factor-kappa B，NF_kB)，以 及白介素8(IL_8)信号调控因子蛋白激酶B((serine/threonrine kinase，Akt)等，IL-6、 IL-1和IL-8信号可能刺激GSCs的生长和生存，其受体和糖蛋白优先表达于GSCs，阻断其 受体或干扰炎性分子的表达能抑制GSCs的增殖达到阻碍肿瘤的生长及延长荷GSCs来源 的胶质瘤鼠的生存期及明显消弱了 GSCs的增殖能力。在人类胶质瘤细胞中缺氧可导致 miR-124下调，从而使得STAT3、NF-kB和Akt激活，促使人类胶质瘤干细胞的自我更新、增 殖和侵袭能力。
[0007] 本发明通过研宄发现了 BDNF可以与胶质瘤干细胞膜上BDNF受体结合激活环腺 苷酸反应元件结合蛋白 1 (cyclic AMP-response element binding proteinl，CREB1)的 表达，miR-124启动子中存在着CREB1结合域，通过CREB1与miR-124启动子域结合活化 miR-124表达，高表达的miR-124可以靶向作用于STAT3、NF-kB和Akt，抑制其的激活，从 而影响炎性分子IL-6、IL-1和IL-8信号刺激的GSCs生长和生存，同时也干扰了 IL-6、IL-1 和IL-8等炎性分子的分泌，阻断了 GSCs自分泌刺激机制，抑制了 GSCs的增殖和自我更新 能力，导致阻止了胶质瘤生长与转移复发。
[0008] 本发明提供了一种抑制胶质瘤生长的BDNF4过表达间充质干细胞的制备方法，其 中，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备 成过表达BDNF的间充质干细胞。BDNF基因片段通过正常组织中DNA聚合酶链式反应（DNA polymerase chain reaction，PCR)扩增或者化学合成法获得，经酶切位点连接到病毒载体 上，包装到病毒表达系统上后转染人间充质干细胞，获得过表达BDNF的间充质干细胞。
[0009] 人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSC)具有多向分化潜能、造 血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，在体内或体外特定的诱导条件下， 可分化为脂肪、骨、软骨、神经、内皮等多种组织细胞。本发明利用其干细胞归巢趋化功能， 可以定向迀移到脑部受损的部位，发挥着神经细胞修复和免疫调控的作用，是目的基因过 表达理想的载体，能定位到治疗部位过表达BDNF，激活胶质瘤表达miR-124从而达到治疗 癌症的作用。
[0010] 由于人间充质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得， 也可以作为异体规模化生产，这样一来制备抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细 胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人间充质干细胞来源人废弃脐 带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织等，优选地，来源于人自体骨髓。
[0011] 本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、 腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。
[0012] 本发明提供所述的过表达BDNF的间充质干细胞，体外实验中与胶质瘤干细胞共 培养，启动了胶质瘤干细胞中miR-124表达，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表 达，从而抑制了胶质瘤干