一种人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种Krt9基因的特异位点c. 434delAinsGGCT突变动物模型的构建方 法以及动物模型在人表皮松解性掌跖角化症中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 小鼠（Mus musculus)是一种非常好的可用于研究人类疾病的致病病因、分子机 制、药物以及治疗方法的动物模型。基因打靶胚胎干细胞法是通过同源重组部分替换小鼠 打靶基因的DNA序列，所产生的小鼠的表型是这部分DNA序列重要功能的反映。由基因打 靶技术获得的动物模型，可用以从整体观察实验动物，推测相应基因的功能，因而这项技术 得到了国际公认，发明该技术的三位科学家Capecchi、Smithies和Evans获得了 2007年的 诺贝尔医学奖。迄今，通过基因打靶技术建立的人类疾病小鼠模型已超过500多种。这些 模型的建立，极大地丰富了人类对疾病相关基因功能的了解，为疾病机制的研究、新药研发 和治疗方案评价提供了重要的宝贵的遗传资源。
[0003]表皮松解性掌妬角化症（epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK。 0MIM :144200)是一种相对常见的致残性常染色体显性遗传性皮肤病，也是最常见的掌跖 角化症亚型。EPPK患者出生后数周到数月即有表征，持续终生。临床表现为掌、跖的整个 表皮有弥漫性的角质增厚，表面光滑，色黄，在增厚的周边有明显的红斑缘。手掌和脚掌易 皲裂，产生疼痛感。症状加剧时，手指活动困难。某些EPPK患者可伴有指节垫、先天性指屈 曲和断指等症状。组织病理学检查可见在表皮上基底棘层和颗粒层的角质形成细胞的核周 边形成空泡及细胞裂解，电镜观察有角蛋白和张力丝的异常聚集物。Covello等（1988)对 北爱尔兰进行的流行病学调查数据显示，EPPK的发病率为4. 4/100000。由于本病呈常染色 体显性遗传方式，患者生育患病子代的风险高达50%。目前，临床上尚未出现有效的治疗 EPPK方法。因此，EPPK严重影响患者的工作、生活质量、婚姻和家庭，带给患者及其家属终 身的痛苦。
[0004] 角蛋白9基因（KRT9)是EPPK的主要致病基因，外显率为100%。根据国际人 类中间丝数据库（Human Intermediate Filament Database，www.interfil.org)截止 2014年6月的统计数据，在多个种族或民族的EPPK家系或散发病例中已经发现了 27种 不同的KRT9基因，包括23种错义/无义突变、2种插入突变、1种缺失突变和1种小插 缺突变（small indel)。KRT9基因第1外显子第500位核苷酸的碱基小插缺（indel) 突变（c. 500delAinsGGCT)，将导致K9分子第167位酪氨酸缺失并插入色氨酸和亮氨酸 (p. Tyrl67delinsTrpLeu)，为KRT9基因首次报道的插缺突变类型。indel突变是一类相对 罕见的基因突变类型。截止2014年4月的统计数据，在HGMD中收录的indel仅占所收录 基因突变总数的1. 46%。绝大多数的indel与人类疾病相关，它们很少作为DNA多态性存 在于健康人群中。因此，indel的生成机制可能更为复杂，其在疾病发生中的意义远大于 DNA点突变。带有同源的Krt9基因c. 434delAinsGGCT突变的小鼠，其表型与人EPPK十分 相似，因而是一种非常好的人EPPK的疾病模型。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用基因打靶技术产生Krt9基因突变的小鼠，从而产 生一种人表皮松解性掌跖角化症动物模型的方法。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种人EPPK小鼠模型的构建方法，所述方法为：（1)将小鼠Krt9基因 第434位的A突变为GGCT，构建SEQ ID NO: 1所示含有重组Krt9基因的打靶载体质粒；（2) 将含有重组Krt9基因的打靶载体质粒电转入小鼠胚胎干细胞，得到携带有重组Krt9基因 的小鼠胚胎干细胞；（3)将携带有重组Krt9基因的小鼠胚胎干细胞显微注射入白化的小鼠 囊胚期细胞中，将注射完毕后的囊胚期细胞移入假孕母鼠（优选2. 5d)子宫内待产，移植后 (优选第17. 5天）获得嵌合鼠；(4)将嵌合率>50 %的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J 雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠，筛选携带有重组Krt9基因的小鼠，即为模拟人表皮 松解性掌跖角化症的小鼠模型。
[0008] 进一步，优选所述小鼠为C57BL/6N品系小鼠。
[0009] 进一步，重组Krt9基因质粒载体构建的技术路线为：
[0010] (1)以 Krt9-BAC 质粒为模板，在引物 PCR1F 和 PCR1R、PCR2F 和 PCR2R、PCR3F 和PCR3R的作用下进行PCR扩增，分别获得扩增产物Krt9-PCR1、扩增产物Krt9-PCR2 和扩增产物Krt9-PCR3 ;将Krt9-PCR1与载体PL253连接形成质粒Krt9-PCR1-PL253， 再将扩增产物Krt9-PCR2与质粒Krt9-PCR1-PL253通过双酶切后进行连接，形成质粒 Krt9-PCR1-PCR2-PL253,然后将扩增产物 Krt9-PCR3 与质粒 Krt9-PCR1-PCR2-PL253 经双酶 切后进行连接，形成质粒Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253 ;
[0011] ⑵将pUC57-krt9CDS载体的第434位的核苷酸A突变为GGCT，形成片段 Krt9-5ARM ;然后以Krt9-BAC质粒为模板，在引物Krt9-3Arm-F和引物Krt9-3Arm-R的作用 下进行PCR扩增，合成扩增产物Krt9-3ARM ;将片段Krt9-5ARM和扩增产物Krt9-3ARM与载 体 PL452 连接，形成质粒 Krt9-3ARM-5ARM-PL452 ;
[0012] (3)将质粒 Krt9-3ARM-5ARM-PL452 与质粒 Krt9-PCR1-PCR2-PCR3-PL253 通过同源重组形成Krt9-突变-loxp-ne〇-loxp-PL253载体，然后再将Krt9-突 变-loxp-ne〇-loxp-PL253载体进行BstZ17I酶切改造，去除上述步骤（1)三片段PCR扩增 产物连接时启动子区引入的BstZ17I酶切位点，获得用于小鼠胚胎干细胞基因打靶的含有 重组Krt9基因的终载体,核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013] 进一步，小鼠胚胎干细胞打靶生成模拟人EPPK的小鼠模型的技术路线为：
[0014] (1)上述所构建的与人EPPK患者携带的KRT9突变c. 500delAinsGGCT同源性的小 鼠Krt9基因c. 434delAinsGGCT突变打靶载体中，包含用于筛选阳性中靶小鼠胚胎干细胞 克隆的药筛作用元件loxP-NEO/Kan-loxP片段。用Not I处理质粒，使之线性化，将欲转入 小鼠胚胎干细胞的质粒载体的DNA浓度调整约为1 y g/yl;
[0015] (2)将Krt9基因c. 434delAinsGGCT突变打靶载体电转入C57BL/6N小鼠胚胎干细 胞，挑选同时抗遗传霉素（G418)和丙氧鸟苷（GANC)的单克隆小鼠胚胎干细胞，并通过PCR 反应、Sanger DNA测序和Southern杂交，得到携带有Krt9基因c. 434delAinsGGCT突变的 阳性中靶小鼠胚胎干细胞；
[0016] (3)将携带有Krt9基因c. 434delAinsGGCT突变的阳性中靶C57BL/6N小鼠胚胎干 细胞显微注射入白化的C57BL/6小鼠囊胚期细胞中，将注射完毕后的囊胚移入2. 5d的假孕 母鼠子宫内待产，移植后的第17. 5天获得Krt9基因c. 434delAinsGGCT突变嵌合C57BL/6 小鼠；
[0017] (4)挑选"步骤（3) "中嵌合率>50 %的雄性嵌合体小鼠，与野生型C57BL/6J雌性 小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠。对新生小鼠进行基因型-表型筛选，得到携带重组Krt9 基因且足垫区皮肤发育异常的小鼠，即获得人表皮松解性掌跖角化症小鼠模型。
[0018] 本发明构建的Krt9基因敲入小鼠模型在出生后3?4周即出现前、后爪足垫区皮 肤黑色过度角化斑，且随着时间的推移更加趋向明显，表型出现增厚-蜕皮-增厚的变化， 周期为3周左右。表明该模型小鼠在表型上高度模拟人EPPK的临床表现。小鼠的基因型 包括纯合子、杂合子与野生型。迄今，国内外文献报道、专利数据库和包括世界最大的小鼠 资源中心美国Jackson研究所在内的动物模型目录中，均未见相关EPPK/Krt9基因敲入小 鼠的信息。因此，本发明的小