一种用于雄激素受体转录后修饰位点预测的体外迷你报告基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种用于雄激素受体转录后修饰 位点预测的体外迷你报告基因及应用。
【背景技术】
[0002] 癌症占人类死亡病因的近1/4。在过去的几十年里肿瘤复发和转移仍是改善整体 存活率的主要障碍，这可能主要归因于人们对于癌症生物学仍然缺乏全面的了解。例如，功 能基因组学研究的最新进展表明，参与人类基因转录的绝大多数是非编码RNA包括长链非 编码RNA(lncRNAs)。然而，对于IncRNAs在调控癌症基因表达及机制等方面人类仍然所知 甚少[1]。
[0003] 近期我们通过对肿瘤表观遗传机制的研究发现IncRNAs可以通过多种机制调控 肿瘤的进展。新近有研究表明lncRNAPCGEMl可以与雄激素受体（AR)结合作用[2]。PCGEM1 在前列腺癌上调[3]，可促进细胞增殖[4]，而我们则通过临床标本研究发现，PCGEM1以及 PCAT1的基因表达与前列腺癌恶性程度及转移复发呈高度相关性，PCGEM1不但可以通过与 AR直接作用，更重要的是PCGEM1与AR异构体，如AR-V7 (AR3)的表达呈高度正相关，我们 进一步证明了PCGEM1通过选择性转录修饰调控了AR的异构体如AR3的表达。由此发现 IncRNAs如PCGEM1可能通过调控AR基因转录的表观遗传机制参与AR相关肿瘤的增殖、恶 性侵袭复发及转移驱动。因为在一定程度上是由于AR的异构体如AR3介导了该类肿瘤的 激素去势抵抗，而并非野生型全长AR。而研究已表明AR3在AR在很大程度上诱导形成了相 关肿瘤如前列腺癌的激素去势抵抗[5]。
[0004] 针对上述AR相关肿瘤的特异性调节lncRNAPCGEMl显著参与调控了与该类肿 瘤的激素去势抵抗相关AR异构体（如AR3)的表达。本发明是建立在研究所表明的 lncRNAPCGEMl或hnRNPAl和U2AF65参与调控的表观遗传机制的基础上，即IncRNAsPCGEMI 通过调控雄激素受体异构体AR3pre-mRNA的转录后修饰及共定位，直接决定了表达雄激素 受体的肿瘤如前列腺癌、肺癌及乳腺癌等的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移。
[0005] 本发明涉及的迷你报告基因质粒主要是建立在表观遗传机制调控的基础上，如 lncRNAPCGEMl通过调控雄激素受体异构体AR3pre-mRNA的转录后修饰，直接决定了表达雄 激素受体的肿瘤如前列腺癌、肺癌及乳腺癌等的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移。应 用该迷你报告基因，可以验证IncRNAPCGEM1或hnRNPAl,U2AF65等转录修饰剪切因子的作 用机制。上述调节因子可以通过该迷你报告基因上表现出经基因转录后修饰机制对雄激素 受体（AR)异构体产生的调控作用。一方面，该迷你报告基因用于预测前列腺癌等雄激素受 体相关肿瘤的激素去势复发及转移的高度危险因子；另一方面，通过该迷你报告基因，可以 能够直观和高效、准确的验证和阻断该特异性目标基因位点的表达及作用。最终服务于临 床雄激素受体相关肿瘤的激素去势治疗后复发及转移的靶向治疗。为临床有效靶向阻断 PCGEM1所介导的雄激素受体异构体AR3,可以有效的降低雄激素受体（AR)相关肿瘤的激素 去势治疗后的去势抵抗和复发转移情况。本发明的AR3迷你报告基因及试剂盒是基于当前 最新的研究结果而建立。这是一种目前其他方法都无法替代的技术方法，迄今为止尚未见 相关报道。
[0006]参考文献：l.Xie C, Yuan J, Li H, Li M，Zhao G，Bu D，et al. N0NC0DEv4:exploring the world of long non-coding RNA genes. Nucleic acids research. 2013；doi:10.1093/nar/gktl222.
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[0008] 3. Srikantan V，Zou Z，Petrovics G，Xu L，Augustus M，Davis L，et al. PCGEM1，a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer. Proceedings of the NationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica. 2000；97:12216-21.
[0009] 4. Petrovics G, Zhang W, Makarem M, Street JP, Connelly R, Sun L, et al.Elevated expression of PCGEM1，a prostate-specific gene with cell growth-promoting function, is associated with high-risk prostate cancer patients. Oncogene. 2004 ;23:605_11.
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【发明内容】
[0011] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于雄激素受体转录后修饰位 点预测的AR3迷你报告基因。
[0012] 本发明的再一的目的是，提供所述迷你报告基因的用途。
[0013] 本发明的另一的目的是，提供一种用于检测和定量细胞中的AR3表达的试剂盒。
[0014] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0015]一种用于雄激素受体转录后修饰位点预测的AR3迷你报告基因，包含序列如SEQ ID N0. 13所示的核苷酸序列。
[0016] 所述AR3迷你报告基因通过下述方法克隆构建组成：
[0017] a)通过PCR法，以SEQ ID NO. 1及SEQ ID N0. 3所示的序列作为引物，以人类基因 组DNA为模板扩增AR的外显子exon3和部分内含子序列（长2. 3kb);
[0018]b)通过PCR法，以SEQIDNO. 2及SEQIDNO. 5所示的序列作为引物，以人类基因 组DNA为模板扩增AR的内含子加上部分外显子exon3b序列（E3b，序列长lkb);
[0019] c)以SEQ ID NO. 4及SEQ ID NO. 6所示的序列作为引物，应用PCR法扩增 mCherry；
[0020] d)将a)、b)和c)扩增产物通过常规方法顺序连接克隆进p⑶H-Pu载体（SBI)，插 入位点为EcoRI和NotI酶切位点。
[0021] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0022] 所述的AR3迷你报告基因在制备药物中的应用。
[0023] 所述的AR3迷你报告基因在制备治疗癌症药物中的应用。
[0024] 所述的癌症是实体瘤，或所述的癌症细胞来源于实体瘤。
[0025] 所述的癌症为前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌或结肠癌。
[0026] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0027] -种用于检测和定量细胞中的AR3表达的试剂盒，包含：
[0028]a)上述的AR3迷你报告基因；
[0029]b)适合重配a)的盐水或缓冲溶液。
[0030] 本发明目的是提供一种用于雄激素受体（AR)转录后修饰位点预测的体外迷你报 告基因及其应用。
[0031] 所述迷你报告基因用于诊断AR相关肿瘤的激素去势复发、转移及其他相关肿瘤， 用于协助靶向治疗AR相关肿瘤疾病。
[0032] 所述迷你报告基因克隆构建引物如下所示：
[0033]pCDH-Myc-Rl-AR3-E3_5. 1(SEQ ID NO.1):
[0034]CCATGGAGGCCCGAATTCTGGGGAAACAGAAGTACCTGTGC
[0035]AR-I3-5. 2+13-3. 1-R(SEQ ID NO.2):
[0036] CTGGGTGGCTGCGTGTTTTTTAAACTAGATCTGCCTGACT
[0037]AR-I3-5. 2+13-3. 1-F(