固定化脂肪酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及固定化脂肪酶，尤其是涉及一种固定化脂肪酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（EC3. 1. 1.3)又称三酰甘油酯水解酶，是催化酯类化合物的分解、合 成、醋交换等多种反应的一类酶的总称[1]。南极假丝酵母脂肪酶B(Candidaantarctica lipaseB，CALB)是一种重要的脂肪酶，具有很多优良特征，对水相和非水相的反应都有很 强的催化能力，尤其是在氨解反应上得到广泛的应用。然而，脂肪酶的应用往往也受到酶活 力低、稳定性差、回收利用困难等因素的影响，但是如果酶被固定化后再使用，可以在很大 程度上避免这些问题。目前已经商业化的固定化脂肪酶是诺维信的Novozym435,但是由于 其价格昂贵，无法在工业上大规模利用。
[0003] 用于固定化酶的载体主要分有机材料和无机材料两大类，无机材料中的介孔二氧 化娃就被广泛应用在酶的固定化研宄中。介孔二氧化娃（mesoporoussilica,MPS)是一种 多孔材料，孔径介于2?50nm，具有极高的比表面积、规则有序的孔道结构、狭窄的孔径分 布、孔径大小连续可调[2, 3]等特点，是一种用于制备固定酶的不错的载体。
[0004] 介孔材料固定蛋白质酶的方法有很多，例如吸附、交联都是比较常用的传统方法， 但是这种通过物理方法固定得到的蛋白酶在催化的过程中容易浸出，酶分子很容易从载 体上脱落下来，而载体与酶通过形成共价键得到的固定化酶就没有这些缺陷。目前，国内 外已经有许多研宄者做了介孔材料对酶的固定化方面的研宄。B.Paul[4]等人用介孔硅胶 MCM-42和功能化的SBA-15将微过氧化物酶进行固定化研宄，提高了酶的稳定性和使用寿 命；DirkJung[5]将葡萄糖氧化酶共价结合固定在化学改性的SBA-15上，该固定化酶与游 离酶相比，贮藏稳定性明显得到提高，与通过物理吸附固定的酶相比，酶的浸出现象得到良 好改善。FalahatiM[6]等人将0-乳球蛋白-B成功固定在胺官能化的纳米二氧化娃KIT-6 上，得到的固定蛋白比游离蛋白的耐热能力更高。MichelaVittorini[7q_厌氧乙醇脱氢 酶固定在介孔二氧化硅SBA-15上，与游离酶相比，固定化酶在有机相中的稳定性显著增 强。Bai[8]等人利用改性的介孔二氧化硅固定脂肪酶，固定化酶相比游离酶的催化活性有 明显提高。GanapatiD[9]等人以六角介孔二氧化娃为载体通过物理方法将洋葱假单胞菌 脂肪酶和CALB分别进行固定化，酶的回收活力仅仅26%。EmilDumitriu[1°]等人用物理 吸附的方法将CALB固定在介孔二氧化硅MCM-36上，吸附量仅仅达到4mgCALB/g载体。Yu Han[11]利用压力驱动法将CALB固定在MPS上，固定化酶的可重用性和热稳定性都优于商业 化的Novozyme435。RosaM. [12]同样也是利用物理方法将CALB固定在MPS上，将固定化酶 与Novozyme435进行对比研宄，固定酶的稳定性和重复利用性都很高。
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【发明内容】
[0018]本发明的目的在于提供一种固定化脂肪酶的制备方法。
[0019] 本发明包括以下步骤：
[0020] 1)将菌种活化、培养后上罐发酵得游离酶液；
[0021]在步骤1)中，所述菌种为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)CALB，该菌种已于 2015年01月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址 为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所，邮编：100101，保藏中心 登记入册编号为：CGMCCNo. 10277 ;
[0022] 所述活化的方法可为：从甘油管中接500?1000yL菌液到装有25mLYH)培养基 的250mL的锥形瓶中，30°C、200rpm回转式摇床培养24?48h，转接一次；所述YPD培养基 的组成为：l〇g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖；
[0023] 所述培养的方法可为：将活化后菌体按5%?10%的接种量接种到装有50mL BMGY培养基的500mL锥形瓶中，30°C、200rpm回转式摇床培养12?36h;所述BMGY培养 基的组成为：l〇g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，13. 4g/LYNB，0. 4mg/L生物素，10g/L甘油， pH6. 0的lmol/L磷酸钾缓冲液；
[0024] 所述上罐发酵的方法可为：将种子液按5%?10%的接种量接种到BSM培养基中， 发酵开始12h后，2?4h内流加50%甘油作为碳源，24h后，平均每24h补加80?160mL甲 醇，诱导菌体产酶，120?144h后停止发酵，离心去菌体收集发酵上清液，获得游离酶液；所 述BSM培养基的组成为：甘油 40g/L，磷酸 26. 7mL/L，CaS04 ? 2H20 0? 93g/L，K2S0418. 2g/L， MgS04 ? 7H2014. 9g/L，KOH4. 13g/L，PTM14mL/L，pH用氨水调为 6. 5。
[0025] 2)制备中空介孔Si02，具体方法如下：
[0026] 将无水乙醇和去离