一种苹果茎沟病毒实时荧光定量pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒分子检测领域，具体而言，涉及一种苹果茎沟病毒实时荧光定量 PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 苹果莖沟病毒（Apple stem grooving virus，ASGV)能侵染苹果、梨、柑橘、杏、李、 樱桃、猕猴桃、百合等园艺作物，可导致多种病毒病。ASGV侵染苹果树体后一般不表现症状， 但能引起慢性衰退病，严重时可使产量减少45% -73%，导致果实品质下降，对苹果生产造 成严重影响。
[0003] 目前检测ASGV的方法以常规RT-PCR技术为主。虽然郭立新等（2006)设计了 Taqman-MGB探针，建立了检测库尔勒香梨中ASGV的实时荧光定量PCR方法，但应用该方法 未能检测到苹果样品中的ASGV，且该方法没有制作标准品，无法对样品中的病毒进行绝对 定量检测，另外Taqman-MGB探针的价格较普通Taqman探针更为昂贵，不利于大范围推广应 用。
[0004] ASGV的常规RT-PCR检测技术方案包括以下步骤：
[0005] 1、设计常规RT-PCR检测引物；
[0006] 2、提取果树供试样品的RNA并反转录成cDNA ;
[0007] 3、以cDNA为模板，利用特异扩增引物进行常规PCR扩增；
[0008] 4、将扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳；
[0009] 5、通过凝胶成像系统对电泳结果进行观察拍照，若观察到特异扩增条带可证明供 试样品中含有ASGV，反则没有。
[0010] 然而，ASGV的常规RT-PCR检测技术存在缺点：
[0011] (1)、操作步骤较为繁琐，费时费力；
[0012] (2)、需要对PCR扩增产物进行后处理，只有将扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳才能 得到检测结果，但琼脂糖凝胶制作过程中需要加入致癌物质EB，易污染实验室环境，还会对 实验人员的健康构成威胁，同时后处理过程中不同样品间易发生交叉污染，造成检测结果 的假阳性现象；
[0013] (3)、常规RT-PCR技术只能对病毒进行定性检测，无法定量检测
[0014] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的在于提供一种苹果茎沟病毒实时荧光定量PCR检测方法，该检测方 法具有可实现供试材料苹果茎沟病毒的定量检测、不存在假阳性以及环境污染、检测时间 短以及灵敏度高的技术效果。
[0016] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0017] 本发明提供了一种苹果茎沟病毒实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
[0018] I)、以染毒材料的cDNA为模板，以ASGV-cp-F和ASGV-cp-R为引物进行PCR扩增， 所获扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收并用载体连接后转化到感受态细胞，挑取阳 性克隆增菌培养后进行质粒提取和鉴定，得到阳性重组质粒标准品；
[0019] 2)、以经过梯度稀释的所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和以该浓度的阳性 重组质粒标准品为模板、以ASGV-Probe-F和ASGV-Probe-R为引物、以ASGV-Probe为探针 所进行的实时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线；
[0020] 3)、以供试材料的CDNA为模板，按照与步骤2)相同的扩增条件进行实时荧光定量 PCR，得到的Ct值与所述标准曲线进行比对，实现供试材料苹果茎沟病毒的定量检测；
[0021] 其中，所述 ASGV-cp-F、ASGV-cp-R、ASGV-Probe-F、ASGV-Probe-R 和 ASGV-Probe 的 核苷酸序列分别如 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID NO: 5所示。
[0022] 本发明提供的这种检测方法，其采用染毒材料的cDNA为模板，通过特定的引物扩 增出产物，该产物再通过载体连接以及转化之后，获得大量复制的片段，挑取阳性克隆增菌 培养并进行质粒提取和鉴定（酶切鉴定）进而获得阳性重组质粒标准品。根据该阳性重组 质粒标准品分子量将其换算成拷贝数浓度，并梯度稀释；然后以该浓度的阳性重组质粒标 准品为模板、以ASGV-Probe-F和ASGV-Probe-R为引物、以ASGV-Probe为探针所进行的实 时荧光定量PCR的Ct值构建标准曲线（Ct值-拷贝数浓度）。上述反应中，ASGV-Probe-F、 ASGV-Probe-R和ASGV-Probe为特定设置的特异性扩增引物和探针，且在ASGV-Probe的5' 端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
[0023] 以供试材料的cDNA为模板按照与构建上述标准曲线相同的条件进行实时荧光定 量PCR，通过供试材料反应的Ct值以及标准曲线，直接获得供试材料中的苹果茎沟病毒的 含量。
[0024] 该方法实现了供试材料中的苹果茎沟病毒的定量测定，而且检测结果可直接通过 电脑软件读出，不需要凝胶电泳以及成像检测等操作，进而避免了检测结果假阳性的同时 也避免了环境污染以及EB对操作人员造成的身体危害。另外，该检测方法整个检测过程仅 需1小时左右，具有节约时间以及灵敏度高的优点。
[0025] 可选的，在步骤1)中：所述染毒材料的cDNA的制备方法包括：
[0026] 提取感染有苹果茎沟病毒材料的总RNA，并以该RNA为模板进行反转录，得到染毒 材料的cDNA。
[0027] 通过提取感染有苹果茎沟病毒材料的总RNA，再进行反转录获得染毒材料的 cDNA，该方法操作简便，易于实现。
[0028] 可选的，在步骤1)中，所述琼脂糖凝胶电泳中所用的琼脂糖凝胶的浓度为1-2%。
[0029] 可选的，在步骤1)中：所述载体为PEASY-T3，所述感受态细胞为E. coli DH5 α。
[0030] 扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳后切胶回收片段，且为了获得大量复制的目标片 段，该回收片段利用PEASY-T3连接后转化到Ε. coliDH5 α感受态细胞中，通过挑取阳性克 隆进行增菌培养，再用质粒小量提取试剂盒提取后测序和酶切鉴定。经鉴定正确的阳性重 组质粒作为阳性重组质粒标准品。
[0031] 可选的，在步骤2)中：
[0032] 所述阳性重组质粒标准品的0D26Q/0D28Q比值在1. 8-2. 0之间。
[0033] OD26(l/OD28(l比值在I. 8-2. 0之间的阳性重组质粒标准品，其纯度高，因此制成的标 准曲线能够更加准确的反应Ct值与起始模板拷贝数浓度的关系。
[0034] 可选的，在步骤2)中：
[0035] 所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度范围为：1. OX IO8拷贝/ UL?1.0X101 拷贝/ μ L，且所述梯度稀释的倍数为10倍。
[0036] 10倍稀释梯度的阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度和其进行荧光定量PCR反应 的Ct值的散点坐标均匀，更易获得高相关系数的标准曲线；而且LOXlO 8拷贝/yL? I. 0X IO1拷贝/ μ L检测范围大，提高了供试材料病毒检测的广泛性。
[0037] 可选的，在步骤2)中：
[0038] 所述标准曲线以所述阳性重组质粒标准品的拷贝数浓度的对数值为横坐标，以所 述Ct值为纵坐标。
[0039] 可选的，在步骤2)中，所述实时荧光定量PCR的过程中，反应体系为：
[0040] TransStart Probe qPCR Super Mix 10 μ L，ASGV-Probe-F 和 ASGV-Probe-R 4_5pmol，ASGV-Probe 4_5pmol，模板 I. 0 μ L，双蒸水补齐至 20 μ L0
[0041] 可选的，在步骤2)中，所述实时荧光定量PCR的过程中，扩增程序为：
[0042] 94°C预变性 30-35s ;94°C变性 4-7s，55°C退火 12-15s，72°C延伸 15-20s，共 35-40 个循环。
[0043] 该扩增程序下，其扩增特异性好。
[0044] 可选的，所述实时荧光定量PCR采用Bio-Rad iQ?5实时荧光定量PCR仪进行。
[0045] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0046] (1)、通过标准曲线实现对供试材料中ASGV病毒的定量检测，而常规PCR技术只能