一种水稻叶片亲水基因的分子标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子育种领域，具体涉及一种因水稻表皮蜡质缺少而引起叶片亲 水基因的分子标记方法，在杂交水稻育种过程中利用该分子标记进行辅助选择引入水稻叶 片亲水基因可作为标记性状加速改良水稻品种。
【背景技术】
[0002] 植物表皮蜡质是各种脂类化合物组成的一层疏水屏障，覆盖在陆生植物地上大部 分器官的表面，是植物表面的重要结构。表皮蜡质具有阻止植物非气孔性失水、维持植物表 面清洁与植物表面防水、抵御病虫害、防止有害光线对植物的损伤、反射可见光、影响叶片 和果实着色、防止果实开裂等生理功能，另外蜡质对植物叶片和果实的形态发育和花粉发 育也有重要影响，进而影响植物的育性以及产量。
[0003] 水稻不仅是研究分子生物学的模式植物，更是我国的第一大粮食作物。然而 作为单子叶模式植物的水稻，调控蜡质形成、积累的遗传网络研究还十分匮乏，迄今只 有 OsWSLl-l/Wax Crystal-sparse Leaf2(WSL2)、Wax Crystal-sparse Leafl(WSLl)、 Wax-deficient antherl (Wdal)、0sWSLl-6等极少数几个表皮錯质合成基因被克隆，因此， 发掘更多的水稻表皮蜡质突变体对水稻等单子叶植物表皮蜡质形成、积累的分子调控机理 研究具有重要意义。
[0004] 在水稻育种实践中，育种家尝试通过给杂交稻的不育系添加某种苗期易于识别的 隐性形态标记，来增加杂交稻的安全系数。叶片表型在苗期就能识别，是鉴别品种最简单、 快捷和有效的方法，但绝大多数标记性状对植株本身存在不利影响。
【发明内容】
[0005] 发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种水稻叶片亲水 基因的分子标记方法。申请人在籼稻镇恢714繁殖群体中发现一株自然突变体，突变体叶 片蜡质含量减少，露水在叶片表面可均匀展布而呈现明显的水渍状淡绿色，露水蒸发后叶 色基本正常，该突变体其余产量性状与野生型无显著差异，具有作为不育系标记性状的潜 力。遗传分析表明该突变性状受1对隐性基因控制，通过突变体与武育粳3号杂交得到的 F2群体，我们已成功地将该基因定位于第3染色体IlOkb的区域内，是一个没有报道的新的 蜡质合成基因，因其位于第3染色体，将该基因命名为Wax Crystal-sparse leaf3 (WSL3)。
[0006] 技术方案：为了解决上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种引物对，所述引 物对包含引物对c3-16和引物对c3-22,所述c3-16的核酸序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示，所述c3-22的核酸序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示。
[0007] 上述的引物对在水稻叶片亲水基因的分子标记方面的应用。
[0008] -种水稻叶片亲水基因的分子标记方法，从中籼恢复系镇恢714繁殖群体中获 得一个自然突变体wsl3,该突变体wsl3分类命名为：水稻（Oryza sativa);保藏号为： CGMCC NO. 10305 ;保藏日期为：2015年1月4日；已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理 中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编： 100101 ;该突变体wsl3受一对隐性基因控制，命名为WSL3,利用突变体wsl3与粳稻品种镇 稻88、武育粳3号衍生的&分离群体，最终将该基因精细定位于水稻第3染色体上IlOkb 的物理区间。
[0009] 上述标记方法是：以突变体wsl3为供体，核心两系不育系或其他水稻材料为受 体，利用两翼分子标记c3-16、c3-22为选择标记，经过4至5个世代的回交可选育出与受体 性状高度相近且携带WSL3突变基因型的标记品系。
[0010] 上述的一种水稻叶片亲水基因的分子标记方法，具体包括以下步骤：
[0011] 1)突变体的获得与性状测定：将突变体WS13分别与粳稻品种镇稻88及粳稻品种 武育粳3号杂交，分别播种亲本、匕及F 2，调查目标性状及获取定位群体；
[0012] 2)突变体基因的遗传分析与分子标记定位：选取突变体wsl3植株叶片及其 野生型亲本相同部位的叶片提取表皮蜡质进行测定分析；简单序列重复标记（SSR)根 据McCouch构建的SSR连锁图获得，插入缺失标记（Indel)及酶切扩增多态性序列标记 (CAPS)运用Primer5. 0软件自行设计；
[0013] 3)突变体基因的分子标记选择与育种利用：根据定位结果，选取两侧紧密连锁的 分子标记c3-16、c3-22为辅助筛选标记，以突变体wsl3为供体，核心两用不育系Y58S为 受体（父本），并对二者进行标记多态性检测，发现存在多态性，于是以受体亲本Y58S为父 本，在海南短日照及句容控温条件下，经一次杂交和4次回交，每次回交后代均用分子标记 选择，选取具有目的基因的单株进行下一次回交，获得Y58S-WSL3近等基因系。
[0014] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
[0015] (1)本发明的水稻叶片亲水基因涉及一个新的表皮蜡质合成基因，是一种新的种 质资源，对其完成了精细定位，获得了紧密连锁的分子标记C3-16及C3-22。
[0016] (2)本发明的水稻叶片亲水突变体在苗期即可辨别，具有作为不育系标记性状的 潜力和价值。将其作为标记性状与杂交稻不育系相结合，在繁、制种时只要去除正常植株即 可达到去杂的目的；在杂交稻F 1移栽前，只要除去带有标记性状秧苗即可彻底去除不育系 自交后代，是提高杂种纯度的一条有效途径。
[0017] (3)本发明定位的水稻叶片亲水基因 WSL3位置明确、精细，鉴定方法快速简单，只 需分析连锁标记的谱带特征，即可判断目标个体是否携带该基因，特别是在回交育种中可 以提高育种效率，加快育种进程。
【附图说明】
[0018] 图1野生型（wild_type，WT)为与突变体（mutant，M)的叶片性状比较；a :卩十片沾 水后的表现，标尺=Icm ;b_e :叶片表皮蜡质结构比较。其中b与d分别为野生型及突变体4 叶期的表皮蜡质结构；c与e分别为野生型及突变体成熟期的表皮蜡质结构，标尺=20 μ m。
[0019] 图2为WSL3基因的定位结果及侧翼标记c3-16、c3-22的位置。
[0020] 图3用于分子标记辅助选择的c3-16、c3-22在wsl3、Y58S两个亲本间及部分后代 单株的基因型检测电泳图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施实例，进一步阐释本发明：
[0022] 实施例1 :
[0023] 1、材料方法
[0024] I. 1植物材料
[0025] 镇恢714是江苏丘陵地区镇江农业科学研究所选育的一个杂交中籼恢复系，在 2007年镇恢714群体繁殖中发现一株叶片表皮亲水突变体，定名为"wax crystal-sparse leaf 3 (wsl3)"。将wsl3突变体分别与野生型亲本及粳稻品种武育粳3号杂交，分别播种 亲本、^及F 2，调查目标性状及获取定位群体。
[0026] 1. 2突变性状的测定与生理性状分析
[0027] 在抽穗期，选取突变体wsl3植株叶片及其野生型亲本相同部位的叶片提取表皮 蜡质，参照周小云等[湖南农业大学学报（自然科学版）第33卷第3期]的方法进行测定， 同时采用扫描电镜观测叶片表皮蜡质结构。
[0028] 1. 3总DNA的提取和分子标记
[0029] DNA提取参照McCouch等（McCouch et al. 1988)的方法进行，略有改动，即在苗期 选取各材料的叶片提取DNA供分子标记分析。具体步骤如下：
[0030] (1)取约0. Ig叶片，剪碎后放在2ml离心管中，置离心管于液氮中，将叶片磨成粉 末状。
[0031] (2)加入600?700μ 1 的2XCTAB提取液（2%CTAB，IOOmM Tris-HCLpH 8. 0,20mM EDTA，I. 4M NaCl)，混匀，置于65°C的水浴中30min，期间振动2-3次。
[0032] (3)从水浴中取出离心管，稍适冷却，加入约700 μ 1的氯仿，充分混匀5min以上， 在