一种检测细菌四环素类耐药基因的引物及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测细菌四环素类耐药基因的引 物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉、土霉素、四环素及 半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。
[0003] 四环素类是主要抑制细菌蛋白质合成的广谱抗生素，高浓度具有杀菌作用。作用 机制在于药物能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰一 tRNA在该位 上的联结，从而抑制肽连的增长和影响细菌蛋白质的合成。其抗菌谱广，对革兰氏阴性需氧 菌和厌氧菌、立克次体、螺旋体、支原体、衣原体及某些原虫等有抗菌作用。
[0004] 四环素类抗生素在临床上多年来由于四环素类的广泛应用，临床常见病原菌包 括葡萄球菌等革兰阳性菌及肠杆菌属等革兰阴性杆菌对四环素多数耐药，并且，同类品种 之间存在交叉耐药。另外，由于四环素类抗生素除了常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌 氧菌外，多数立克次体属、支原体属、衣原体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体也对本药敏感。 对革兰阳性菌的作用优于革兰阴性菌，但肠球菌属对其耐药。其他如放线菌属、炭疽杆菌、 单核细胞增多性李斯特菌、梭状芽孢杆菌、奴卡菌属等对本药敏感。对淋病奈瑟菌具一定抗 菌活性，但耐青霉素的淋球菌对四环素也耐药。对弧菌、鼠疫杆菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶 尔森菌等革兰阴性菌抗菌作用良好，对铜绿假单胞菌无抗菌活性，对部分厌氧菌属细菌具 一定抗菌作用。四环素类抗生素对恶性肿瘤、囊肿、顽固性胸腔积气、积液、支气管胸膜瘘、 急性痘疮样苔藓样糠疹等有相应的疗效，常常使用四环素类及其他类别抗生素的联合用药 方案，另外，近年来发现，四环素局部注射治疗婴儿乳糜胸、癌性心包积液、鞘膜积液、食管 静脉曲张出血等，亦有良好的效果。此外，四环素类抗生素药除用于医疗，还应用于生物科 学研究、农业、畜牧业和食品工业等方面，而且在畜牧业和农业中非治疗用途的抗生素类 药，称为抗生素生长促进剂。
[0005] 近30年来，由于大量治疗用抗生素在临床的不合理应用，临床疾病相关细菌的耐 药性不断增加，引起正常菌群失调和大量耐药菌株出现。耐药菌能够承受住抗生素药物的 攻击，这样一来标准的治疗就失去了效果，感染持续存在并可传染他人。抗生素耐药性是由 使用抗生素药物，特别是对抗生素药物的不当使用造成的，当细菌发生突变或获得耐药基 因时，就产生了耐药性。四环素类药物在临床中的广泛应用使得越来越多的产生了对该类 抗生素耐药的菌株，导致临床治疗失败。另外，因为在畜牧养殖业中广泛使用四环素类抗生 素的情况非常普遍，不仅动物、禽类及鱼类体内残留的抗生素会转移到人体，它们体内产生 的耐药菌和耐药基因也会传播给人类。这样就需要一种能方便快捷的检测细菌耐药性的方 法，从而来及早发现耐药细菌，进而改变用药方案，指导临床治疗。
[0006] 耐药性的检测可以分为常规表型检测（即药敏试验）和耐药基因型检测。常规药 敏试验首先需要通过培养的方法从临床标本中分离到菌株，而许多生长较慢和不易培养的 细菌，是无法通过常规药敏试验检测其耐药性的。在过去的20年，为适应临床需要，以DNA 探针和聚合酶链反应（PCR)为基础的分子手段检测耐药基因取得了很大进展，其中部分方 法已被美国食品和药品管理局（FDA)批准用于临床工作。从最初的定性PCR和电泳到后期 的基因芯片等技术都可以检测细菌抗生素相关耐药基因，但定性PCR及电泳法具有容易污 染、操作繁琐等缺陷，基因芯片技术可同时检测多个耐药基因，但成本也非常高，操作复杂， 所需时间长，不适宜临床大规模推广应用。
[0007] 实时突光定量 PCR 技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对 样品中的DNA(或cDNA)进行定量检测的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量， 而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、成本低廉等特点。目 前已有多种运用定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突 变研究等。
【发明内容】
[0008] 本发明需要解决的技术问题是，提供一种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂 盒，实现对常见细菌四环素类耐药基因 tetA(P)、tetB(P)、tetCl、tetj、tetM、tetQ/P的快 速检测，以弥补现有检测方法的不足。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0010] 检测细菌四环素类耐药基因的引物，包括如下引物对：
[0011] ⑴扩增tetA⑵耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO : 2所示；
[0012] ⑵扩增tetB(P)耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO : 4所示；
[0013] ⑶扩增tetCl耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO : 6所示；
[0014] ⑷扩增tetj耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 所示；
[0015] (5)扩增tetM耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10 所示；
[0016] (6)扩增tetQ/P耐药基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO :11和SEQ ID NO : 12所示；
[0017] 上述6对引物对在一次检测中共同使用。
[0018] 上述检测细菌四环素类耐药基因的引物在制备检测细菌四环素类耐药基因的试 剂中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0019] 一种细菌四环素类耐药基因检测试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：
[0020] (I)PCR反应液：该PCR反应液中含有DNA聚合酶、EvaGreen荧光染料、Mg2+、PCR反 应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP ;
[0021] ⑵引物混合液：将SEQ ID NO :1?10所示的10种引物混合，用双蒸水溶解，每 条引物的浓度为lymol/L ;
[0022] (3)阳性对照：分别含有 tetA(P)、tetB(P)、tetCl、tetj、tetM、tetQ/P 耐药基因 的六种细菌基因组DNA和大肠杆菌基因组DNA的水溶液；
[0023] (4)阴性对照：大肠杆菌基因组DNA的水溶液。
[0024] 其中，阳性对照中，每一种含耐药基因的细菌基因组DNA浓度为IOng/ μ L，大肠杆 菌基因组DNA浓度为50ng/ μ L。
[0025] 其中，阴性对照中，大肠杆菌基因组DNA的浓度为IOOng/ μ L。
[0026] 上述细菌四环素类耐药基因检测试剂盒在检测细菌四环素类耐药基因中的应用 也在本发明的保护范围之内。
[0027] 有益效果：
[0028] (1)通过在NCBI的基因序列库中比对多种菌及临床隔离株四环素类耐药基因 序列，在保守位点处设计的特异性引物，能够对临床常见致病菌6种四环素类耐药基因 tetA (P)、tetB (P)、tetCl、tetj、tetM、tetQ/P 进行快速检测。
[0029] (2)本发明提供的四环素类耐药基因检测试剂盒使用了一种稳定性强、双链结合 特异性高、对PCR反应抑制小的EvaGreen荧光染料，提高了荧光定量PCR扩增的特异性及 稳定性。
[0030] (3)本发明所述的核酸序列和试剂盒具有操作简便、灵敏度高、特异性强、成本低 廉及高通量等优点，可用于辅助临床快速诊断致病性细菌四环素类抗生素的耐药情况，为 临床治疗提供参考依据。
【附图说明】
[0031] 图1为阳性对照品检测结果图。
[0032] 图2为阴性对照品检测结果图。
[0033] 图3为1例大肠杆菌四环素类抗生素耐药基因检测结果图。
[0034] 图4为1例肺炎克雷伯菌四环素类抗生素敏感基因检测结果图。
[0035] 图中英文字母对应的中文名称为：
[0036] Cycles :循环数；Fluorescence :突光值；Amplification Curves :扩增曲线； Select :选择；Zoom :放大。
【具体实施方式】
[0037] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0038] 实施例1 :检测细菌四环素类6种耐药基因耐药基因 tetA(P)、tetB(P)、tetCl、 tetj、tetM、tetQ/P的核酸序列。6对特异性引物委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合 成：
[0039] 扩增tetA(P)耐药基因的引物对：
[0040] F1(SEQ ID NO :1) :5，-GGAGTTTCAGGCTTTTTTGGCTTT-3，，
[0041] R1(SEQ ID NO ：2) ：5' -GGAGTTCTTTGGGATCGTTTTTGT-3;；
[0042] 扩增tetB(P)耐药基因的引物对：
[0043] F2(SEQ ID NO :3) :5，-CACAGAGGATAGAAGCAGGGGATA-3，，
[0044] R2(SEQ ID NO :4) :5，-GAA