抗a亚群禽白血病病毒的细胞系及其构建方法与应用

文档序号:8246689阅读:689来源:国知局
抗a亚群禽白血病病毒的细胞系及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术领域,特别涉及一种抗A亚群禽白血病病毒的细胞系及 其构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 目前禽白血病对我国养禽业的危害严重,并出现了淋巴瘤、髓细胞瘤型和血管瘤 型等多种病理表现型,在临床表现上还容易与网状内皮组织增生症、马立克氏病等肿瘤性 疾病相混淆。该病主要为垂直传播,控制本病有效的措施是降低种鸡群的感染率和建立无 白血病的种鸡群,其主要手段是通过对鸡群定期进行外源性ALV的频度检测,及时淘汰带 毒阳性鸡,以净化和消除鸡群中的ALV。在外源性ALV中,以J亚群、A亚群和B亚群禽白血 病病毒对鸡有明显的致病性,对养禽生产的危害也大。
[0003] 目前,国内外对于禽白血病病原的检测和鉴定方法主要有细胞培养、ELISA、间接 免疫荧光试验、PCR等,其中ELISA在临床上应用最广,其优点是该法操作相对简便,有商品 化的检测试剂盒可以利用,其不足之处是不能区分内源性和外源性ALV ;间接免疫荧光试 验比较直观,但是往往需要用到特异性抗体(单抗)。能够区分不同ALV亚群的PCR引物及 其工作体系已经有报道。
[0004] 在外源性禽白血病病毒的分离上,目前常用的细胞有鸡胚成纤维细胞(CEF)和源 于0系鸡的成纤维细胞系DF-I。美国ADOL实验室基于DF-I细胞系,建立了抗J亚群禽白 血病毒的DF-1/J细胞系。尽管美国ADOL实验室有一些特定的鸡品系,其产生的原代细胞 可以分别限制特定外源性禽白血病病毒生长,但是这些品系鸡的稀有性限制了其效能的发 挥。目前,还没有可特异性地限制A亚群禽白血病病毒的细胞系的相关报道。

【发明内容】

[0005] 为克服现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种抗A亚群禽白血 病病毒的细胞系。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述抗A亚群禽白血病病毒的细胞系的构建方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供所述的抗A亚群禽白血病病毒的细胞系的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种抗A亚群禽白血病病毒的细胞系,命 名为抗ALV-A鸡胚成纤维细胞系DF-1/A ;保藏于中国典型培养物保藏中心;保藏地址为中 国武汉武汉大学;保藏编号为CCTCC NO :C2014180 ;保藏起始日期为2014年10月15日。
[0009] 上述的抗A亚群禽白血病病毒的细胞系的构建方法,包括如下步骤:
[0010] (1)利用带BamHI和NotI酶切位点的引物从含有ALV-A env基因的质粒RCAS(A) 扩增env片段,用限制性内切酶BamHI和NotI分别对扩增的env基因及真核表达质粒 pcDNA3. l/Zeo(+)(购自life公司)进行双酶切,分别纯化后将A亚群禽白血病病毒(ALV-A env)基因片段连接到pcDNA3. l/Zeo(+)真核表达质粒,构建成重组质粒pcDNA-env-A ;
[0011] (2)转移载体pcDNA-env-A在DF-I鸡胚成纤维细胞系表达的基础上,通过Zeocin 药物多次筛选,得到具有Zeocin抗性、可稳定表达ALV-A env蛋白的鸡胚成纤维细胞系 DF-1/A,即抗A亚群禽白血病病毒的细胞系。
[0012] 步骤⑴中所述的带BamHI和NotI酶切位点的引物分别为:
[0013] 上游引物 F:CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATTAAGGCATTTCTGACTGGATACCCT ;
[0014] 下游引物 R: AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATACTATTCTGCTT。
[0015] 步骤⑴中所述的含有ALV-A env基因的质粒RCAS (A)来源于美国ADOL实 验室,具体参见如下文献:Hughes S H. The RCAS vector system[J]· Folia Biol (Pra ha). 2004, 50(3-4):107-119。
[0016] 步骤(2)中所述的Zeocin药物多次筛选的处理方法具体为用200 μ g/mL zeocin 药物对细胞连续筛选30代。
[0017] 所述的抗A亚群禽白血病病毒的细胞系可应用于A亚群禽白血病病毒的诊断。
[0018] 本发明的发明机理:禽白血病病毒囊膜蛋白(env基因编码的病毒糖基化蛋白)是 该类病毒的主要表面蛋白,它决定病毒感染的宿主范围,能诱导产生中和抗体。该蛋白与靶 细胞表面特异性受体识别、结合,是病毒进入细胞,复制所必需的。感染特定亚群ALV后,细 胞表面病毒受体能被该病毒产生的env基因编码的病毒糖基化蛋白封闭,表现出强大的超 感染抗性,能限制相应病毒的再次感染。本发明首先从env蛋白超感染抗性出发,将A亚群 禽白血病病毒env基因插入pcDNA3. l/Zeo(+)真核表达载体构建成转移载体pcDNA-env-A, 然后将载体pcDNA-env-A转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,通过药物Zeocin筛选,获得抗 Zeocin、稳定表达ALV-A env蛋白的抗A亚群禽白血病病毒的细胞系;通过PCR、间接免疫 焚光(IFA)及Western-blot等方法对DF-1/A细胞系的env基因表达进行了检测,并进行 了抗病毒感染检测。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0020] 本发明从env蛋白超感染抗性出发,将A亚群禽白血病病毒env基因插入 pcDNA3. 1/Zeo (+)真核表达载体构建成转移载体pcDNA-env-A,然后将载体pcDNA-env-A转 染鸡胚成纤维细胞系DF-I,通过药物Zeocin筛选,获得抗Zeocin、稳定表达ALV-A env蛋 白的抗A亚群禽白血病病毒的细胞系。所得到的抗A亚群禽白血病病毒的细胞系可以稳定 传代,长期保存;利用ALV超感染的特性,可以有助于准确鉴别ALV的亚群分类,可应用于A 亚群禽白血病病毒的诊断。
【附图说明】
[0021] 图1为抗A亚群禽白血病病毒的细胞图。
[0022] 图2为PCR检测DF-1/A中env基因结果图,其中:M为Marker,DF-I为阴性对照 组,DF-1/A为阳性组。
[0023] 图3为间接免疫荧光(IFA)检测env基因表达情况的荧光结果图,其中:A为DF-I 细胞组,B为DF-1/A细胞组。
[0024] 图4为Western-blot检测env基因的表达的结果图。
[0025] 图5为抗ALV-A RAV-I和ALV-A⑶13毒株的抗病毒实验检测结果图,其中:A为 抗ALV-A RAV-I毒株,B为抗ALV-A⑶13毒株。
[0026] 图6为抗ALV-J CHN06毒株的抗病毒实验检测结果图
[0027] 图7为临床病毒分群诊断结果图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限 于此。
[0029] 本发明采用了以下技术方案:
[0030] DF-I细胞系:来自农业部兽用疫苗创制重点实验室。
[0031] 毒株:RAV-I和⑶13为ALV-A,CHN06为ALV-J,农业部兽用疫苗创制重点实验室提 供。
[0032] 酶:限制性内切酶BamHI、NotI及T4连接酶购自NEB公司;LA Taq购自TaKaRa公 司。
[0033] 质粒:真核表达质粒pcDNA3. l/Zeo(+)购自Invitrogen公司;RCAS (A)质粒,美国 ADOL实验室馈赠。
[0034] 抗体:ALV-A特异性单克隆抗体,美国ADOL实验室馈赠。FITC标记的山羊抗鼠 IgG 抗体及HRP标记的山羊抗鼠 IgG抗体均购自Simga公司。
[0035] 试剂盒:SQ Tissue组织DNA提取试剂盒,胶回收试剂盒DNA Gel Extraction Kit, 去内毒素质粒抽提试剂盒Plasmid Miniprep Kit为OMEGA公司产品。ALV抗原检测试剂盒 (Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit)为美国 IDEXX 公司产品。
[0036] 细胞培养物:高糖DMEM培养基粉、0. 25%胰酶(含EDTA)、胎牛血清为美国GIBCO 公司产品;二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。
[0037] 本发明扩增ALV-A env基因的上下游引物(F和R)由发明人自行设计:
[0038] F:CGCGGATCCGCCACCATGGAAGCCGTCATTAAGGCATTTCTGACTGGATACCCT
[0039] R:AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTATACTATTCTGCTT
[0040] 反应体系(50 μ L) :LA Taq 25 μ L、上下游引物各 1 μ L、CldH2O 22. 5 μ L、模板 0. 5 μ L0
[0041] 反应程序:95°C预变性5min ;95°C变性30s,57°C退火30s,72°C延伸2min,30个循 环;72°C后延伸8miru
[0042] 用自行设计的引物从RCAS㈧质
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