开菲尔乳杆菌kl22、其筛选方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，涉及一种乳杆菌及其筛选方法，具体涉及一种开菲尔 乳杆菌KL22、其筛选方法及应用。
【背景技术】
[0002] 目前我国规定可用于食品的益生菌仅有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、 干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。开菲尔发酵乳具有众多的益生功能，开菲尔粒含多种生 理性有益菌，黏附定植于肠道中与病原菌竞争黏附位点、营养物质，其代谢的产物乳酸、醋 酸可降低肠道PH值；产生的抑菌物质过氧化氢、细菌素等，能有效抑制致病性微生物在肠 道中的定植。因此，从开菲尔粒中筛选具有明显功能特性的乳酸菌具有非常重要的现实意 义。
[0003] 中国发明专利CN102559561A公开了"一种食源性乳酸菌及其应用"，公开了一株 食源性乳酸菌，乳酸菌的保藏号为CCTCC N0:M2011381，为从臭豆腐卤液中分离出的一株具 有抑菌作用的乳酸菌，可添加到食品中用作食品添加剂。而目前国内外报道表明，采用开菲 尔粒发酵的发酵乳具有抑制有害菌的作用，但是采用开菲尔粒制备发酵乳所带有的特殊口 味为我国消费者所难以接受，并且直接采用开菲尔粒进行大规模工业化生产，操作步骤繁 琐、容易造成污染及批次间差异较大。因此，从开菲尔粒中筛选具有抑菌作用的乳酸菌并将 其应用于发酵乳制备中具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题，是提供一种开菲尔乳杆菌KL22(L3cic^aciA/5· fc/Yri Wrain )它是从波兰卡里什带回的开菲尔粒中分离筛选出来，该益生菌开菲尔乳杆菌KL22 是一株具有很好耐酸耐胆盐特性、发酵特性和黏附肠细胞、抑制有害菌生长的菌株。
[0005] 本发明的开菲尔乳杆菌（ZacioAaci/iAs fc/Yri)KL22,已于2014年9月16日，保 存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC9669,保藏 单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006] 本发明的另一个发明目的是筛选出的开菲尔粒，依次通过分离、纯化、糖发酵特性 实验、分子生物学鉴定、耐酸耐胆盐特性实验、肠细胞粘附特性实验、抑制有害菌特性实验 和菌株发酵特性实验，最终筛选出开菲尔乳杆菌KL22。
[0007] 本发明还有一个发明目的是开菲尔乳杆菌KL22的应用，制备了含有开菲尔乳杆 菌KL22的酸牛奶、乳酸菌饮料、菌粉制剂。与已有乳杆菌相比，开菲尔酸奶乳杆菌KL22对 低PH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更 好地发挥其益生作用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是： 一种开菲尔乳杆菌KL22,该菌菌株已于2014年9月16日，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No. 9669。
[0009] 作为本发明的一种限定，其16SrDNA序列结果如下： TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGT ATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAA CTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTA GCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAG TGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAG CTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCA AGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCT TTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACC CTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAG CCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTAC ACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTT TCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTA CCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCT GTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTC CATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCT CTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAA AGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAG TGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTGGTGTTAAATCATTCA AATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCG 本发明还提供了上述开菲尔乳杆菌KL22的筛选方法，它按照以下步骤顺序进行： (1) 开菲尔粒来源 所选用的开菲尔粒源自波兰卡利什； (2) 菌株的分离、纯化 a、 将开菲尔粒在脱脂奶中活化3代，取开菲尔粒lg，用灭菌生理盐水洗涤后，在灭菌的 研钵中研磨成浆，加入9ml生理盐水进行稀释，取Iml稀释液进行稀释，将稀释度为IO 4UO5 和IO6稀释液涂布在溴甲酚紫-MRS琼脂平板上； b、 将开菲尔粒按5%的接种量接入灭菌的脱脂奶中，30°C培养24h，吸取开菲尔粒发酵 乳lml，用生理盐水进行适当稀释，取稀释度为IO 6UO7UO8的稀释液涂布溴甲酚紫-MRS琼 脂平板； c、 将步骤a和b涂布的溴甲酚紫-MRS琼脂平板置于37°C下厌氧培养72h ;取上述平 板生长良好，具有典型菌落形态并出现颜色变化的菌落进行划线分离，在需氧条件下反复 纯化3次；再经革兰氏染色和接触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性的菌株进行保存备 用，共挑选出疑似乳酸菌50株，其中包括38株杆菌和12株球菌； (3) 糖发酵特性实验 将上述分离纯化38株革兰氏阳性、接触酶阴性疑似乳杆菌菌株挑取单菌落进行平板 划线，37°C培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中于37°C下培养48h，观察颜色 变化，最终根据糖发酵实验颜色变化不同将38株菌株分为8类； (4) 分子生物学鉴定 将上述38株菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序，NCBI 网站blast最终确定38株菌株中包括14株开菲尔乳杆菌、10株保加利亚乳杆菌、8株短乳 杆菌、6株瑞士乳杆菌； (5) 耐酸耐胆盐特性实验 将上述14株开菲尔乳杆菌分别挑取1接种环纯化菌株接种到MRS培养基中，于37°C培 养48h，取出计数；同时，各取ImL该培养基，分别加入到pH为2. 5的磷酸盐缓冲液和3%。含 牛胆盐的MRS培养溶液中37°C孵育，于Oh、3h进行菌数的测定，并计算其存活率；最终筛选 出 6 株菌，分别为 KL02、KL03、KL10、KL18、KL22 和 KL36 ; (6) 肠细胞粘附特性实验 将肠上皮细胞以每孔I mL细胞悬液加入加有盖玻片的24孔板中，于37°C培养箱中 孵育48h ;待细胞贴壁完全，以无菌PBS洗涤2次，每孔加入I mL浓度为IO8个/mL的乳 酸菌悬液，孵育I h ;然后取出盖玻片，用无菌PBS漂洗3次，然后用质量分数为4%多聚 甲醛固定30 min，烘干后用结晶紫染色，于显微镜下观察，随机挑选20个视野，每个视野 50个细胞，计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，最 终筛选出4株菌，分别为KL02、KL10、KL18和KL22 ; (7) 抑制有害菌特性实验 对上述4株具有较好肠上皮细胞黏附特性的菌株进行痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实 验，将肠上皮细胞以每孔I mL细胞悬液加入24孔板中，于37°C培养箱中孵育48h;待细胞 贴壁完全，以无菌PBS洗涤2次，每孔加入IO8个/ml乳酸菌，孵育30min，除去未黏附的 乳酸菌，再加入IO 7个/ml的痢疾志贺氏菌，孵育30min ;然后取出盖玻片，用无菌PBS漂洗 3次，然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30 min，烘干后用结晶紫染色，于显微镜下观 察，随机挑选20个视野，每个视野50个细胞，计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实 验的平均值表示细胞的粘附能力，最终筛选出KL02和KL22两株菌； (8) 菌株发酵特性实验 取鲜牛奶200份，白砂糖18份，调配均匀后，于65°C、15MPa下均质，95°C杀菌300s后， 降温至35-40°C，按照106cfu/ml分别接种KL02和KL22,于37°C发酵24h，发酵结束后对发 酵样品进行感官品评，根据感官品评结果最终筛选出抑制肠道有害菌作用的开菲尔乳杆菌 KL22。
[0010] 作为本发明的一种限定，步骤（3)中所述的糖发酵管中包括：水杨苷、核糖、阿拉 伯糖、麦芽糖、甘露醇、纤维二塘、蔗糖、棉子糖和山梨醇。
[0011] 本发明还提供了上述抑制肠道有害菌作用的开菲尔乳杆菌KL22的应用，该开菲 尔乳杆菌应用于制备功能性乳制品和益生菌菌粉。
[0012] 由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于： 1、 本发明采用的菌株是由开菲尔粒中筛选出的一株开菲尔乳杆菌KL22,该菌株具有很 好的耐酸耐胆盐特性，即通过人体胃和肠道时能够很好的存活，从而可以很好的在人体中 发挥益生作用； 2、 本发明采用的菌株具有很好的黏附肠道和抑制病原菌的作用，因此具有很好的调节 肠道和抑制病原菌侵袭的作用，可用于益生菌菌粉的制备。
[0013] 3、本发明采用的菌株具有良好的发酵特性，因此，可以将其应用于功能性乳制品 的开发中。
[0014] 本发明适用于开菲尔乳杆菌KL22的筛选，及含开菲尔乳杆菌KL22功能性乳制品 和益生菌菌粉的制备。
[0015] 本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实施例1开菲尔乳杆菌KL22与其他乳酸菌基于16SrDNA的菌株进 化树图。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1开菲尔乳杆菌KL22及其筛选方法 开菲尔乳杆菌KL22,该菌株已于2014年9月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No. 9669。
[0018] 其16SrDNA序列结果如下： TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGT ATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCA