一种可在碱性条件下高效预处理木质素原料的云芝栓孔菌及其应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于环境与新能源技术领域，具体涉及一种可在碱性条件下预处理木质素 原料的云芝栓孔菌及其应用。
【背景技术】：
[0002] 木质纤维素是一种可再生资源并且是地球上最丰富的有机物之一。我国的木质纤 维素原料非常丰富，每年仅农作物秸杆就有7亿多吨，加上数量巨大的林业纤维废料和工 业纤维废渣，每年可利用的木质纤维原料总量可达20亿吨以上。因此，木质纤维素在生物 材料领域和生物能源领域具有巨大的潜在应用价值。
[0003] 木质纤维素主要由纤维素、半纤维素及木质素这三种成分组成，其中木质素约占 15% -30 %左右。木质素本身结构复杂，分子量大，不含易水解的单元，是公认的最难以化学 和生物降解的天然高聚物之一。在木质纤维素中，木质素以一种物理屏障存在，紧密地包裹 在纤维素和半纤维素的外面，成为许多工业化过程中有效利用木质纤维素材料的一个主要 障碍。因此，木质素的降解是能否有效利用木质纤维素原料的关键。目前针对木质纤维素原 料中的木质素的去除或者降解主要有三种方法：物理法、化学法及生物法等。物理法主要包 括机械粉碎法、高温液态水法等，这些方法一般都需要高温高压条件及较高的能耗，对条件 要求比较苛刻、对设备要求也比较高，很难被真正应用于实际生产。化学法主要包括酸（如 硫酸、盐酸及一些有机酸等）、碱预处理法包（包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等）等，因为成 本低廉，因此化学法是目前实际应用中最常用的方法，但化学法一般对设备要求比较高、容 易引起环境污染、发酵前需要用大量的酸碱中和、易产生发酵抑制剂等。生物法是是从20 世纪20年代起开始研宄的，采用降解木质素的微生物在培养过程中可以产生分解的酶类， 从而可以专一性降解木质素，除去木质素以解除其对纤维素的包裹作用。此法具有作用条 件温和、能耗低、专一性强，不存在环境污染，处理成本低等优点，具有很大的发展潜力。但 是，目前生物法预处理木质纤维素存在木质素降解微生物种类少，降解条件苛刻，木质素降 解酶类的酶活力低，作用周期长等问题。
[0004] 从目前已有的报道来看，大部分的木质素降解菌降解木质素都是在酸性或者中性 条件下进行的，最适PH范围都在3. 0-7. 0之间，而在碱性条件下利用微生物进行木质纤维 素的预处理还未见报道。由于木质素本身具有在碱性条件下溶解性较高的生理学特性，因 此利用嗜碱性微生物在温和碱性条件下预处理木质纤维素，微生物对木质素的降解作用与 碱性条件对木质素的溶解作用有望形成协同效应，从而提高降解效率，缩短作用周期。
[0005] 利用嗜碱性微生物在温和碱性条件下进行木质纤维素原料的预处理将能很好地 解决生物预处理所遇到的效率低、周期长等问题。这主要基于以下几个方面的原因：（1)在 碱性条件下，微生物在预处理木质纤维素时，不容易被染杂菌，能减少纤维素和半纤维素的 损失；（2)反应条件相对温和（常温常压条件）且成本较低，可以采用低浓度并且可重复利 用的碱性物质如碱石灰或者氨水调节PH ; (3)最重要的是木质素本身具有在碱性条件下溶 解性较高的生理学特性，因此微生物对木质素的降解与碱性条件木质素的溶解作用，有望 形成协同效应，提高降解效率，缩短作用周期。
【发明内容】
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[0006] 本发明的第一个目的是提供一种在碱性条件下高效预处理木质素原料的新菌种： 云芝栓孔菌（Trametes versicolor)T_4。该菌于2014年09月02日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研宄所，保藏编号：CGMCC No. 9582。
[0007] 对菌株的形态特征观察：菌落白色，绒毛状，气生菌丝较发达，在适宜的琼脂培养 基上长时间培养不形成完整的子实体，能够形成菌管。菌丝管状透明，有明显的锁状联合。 担孢子短圆柱形，无色，薄壁，光滑。
[0008] 用真菌DNA提取试剂盒提取云芝栓孔菌（Trametes versicolor)的全基 因，然后以提取的基因为模板，以通用引物NSl :5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3' ；NS4 : 5' -CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3' 进行 PCR 扩增，T-4 的 18S rDNA 序列如 SEQ ID NO :1 所示。 将获得的序列提交NCBI (www. ncbi. nlm. nih. gov)进行Megablast，获取同源性高的相关 序列，用ClustalX软件进行比对，Mega软件进行系统发育分析，采用邻接法构建系统发育 树。根据18S rDNA序列所作的系统发育树如图1所示。扩增得到1.7kbp的基因序列，在 GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，T-4与Trametes versicolor (AY705965. 1) 的同源性为99%，T-4为云芝栓孔菌的新菌株，将其命名为云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4, GenBank 接受号为 KP208683。
[0009] 对云芝检孔菌（Trametes versicolor) T-4的研宄表明：在喊性条件下，15天内对 甘蔗渣中木质素的降解率达到34. 7%，并且其致密结构基本被完全破坏；15天内对玉米秸 杆中木质素的降解率达到28. 3%，并且其致密结构基本被完全破坏。因此，本发明的第二个 目的是提供云芝栓孔菌（Trametes versicolor)T-4在碱性条件下预处理木质素原料的应 用。
[0010] 所述的云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4在碱性条件下预处理木质素原料 的应用，具体预处理方法包括以下步骤：
[0011] (1)、在碱性条件下制备云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4作为降解木质素 的接种物；
[0012] (2)、往木质纤维素原料中加入步骤（1)制备的云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4接种物，静置培养，定期取样测定木质纤维素原料中各成分变化情况。
[0013] 优选，步骤⑴的制备方法为：将云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4从斜面 挑取一小块接入于PDA固体培养基平板上，28-35?静置培养120h，即得到碱性条件下预处 理木质纤维素原料的接种物。
[0014] 本发明中的用于预处理的木质纤维素原料的配制方法为：称取一定重量的粉碎至 60?80目左右的木质纤维素原料，然后按质量比1:2?1:6加入pH8.0?11.0的碱性营 养液，混合均匀后，在温度121°C条件下，灭菌20分钟，冷却后备用。
[0015] 所述的碱性营养液的制备方法为：分别称量NH4NO3 I. 5g，K2HPO4 lg，KH2PO4 I. 2g， MgSO4O. 2g，CaCl2 (λ lg，FeSO4 (λ 05g，MnSO4 (λ 02g，以蒸馏水定容至 1L，然后用 NaOH 调节 pH值到8?11之间。
[0016] 步骤（2)所述的加入步骤（1)制备的云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4接种 物，优选方法为：用灭过菌的打孔器将平板内长满菌丝的固体培养基切成约直径〇. 5mm大 小的块状，每Ig木质纤维素原料降解底物接入2块。
[0017] 所述的PDA固体培养基为本领域技术人员所熟知的常规培养基。
[0018] 本发明提供了一种在碱性条件下高效预处理木质素原料的新菌种：云芝栓孔菌 (Trametes versicolor) T-4,能够解决木质纤维素原料生物预处理效率低、周期长等一系 列问题，在利用木质纤维素原料制备燃料乙醇、沼气等方面具有很大的潜力，为实现木质纤 维素原料的清洁、高效及低成本的预处理奠定基础。
[0019] 本发明的云芝检孔菌（Trametes versicolor) T-4于2014年09月02日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号 院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号：CGMCC No. 9582。
【附图说明】：
[0020] 图1为云芝检孔菌（Trametes versicolor) T-4的18S rDNA系统发育树；
[0021] 图2为云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4在不同pH值条件下的对甘鹿澄中 木质素的降解率变化情况；
[0022] 图3为经过云芝栓孔菌（Trametes versicolor) T-4预处理后甘鹿澄结构变化的 环境扫描电镜（SEM)图，其中，A为原料预处理前扫描电镜图，B为原料预处理后扫描电镜 图。
【具体实施方式】：
[0023] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。<