一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，具体为一种针对肠道细菌的荚膜多糖提取的方 法。
【背景技术】
[0002] 伤寒是由肠道病原体伤寒杆菌引发的严重全身性感染，其传染性强、病程长、易复 发、并发症多，是严重影响人类健康的常见肠道传染病，据WHO的保守估计，全球每年发生 2100万伤寒病例，其中有1^-4%的病例死亡。病例主要集中在发展中国家，尤其亚洲。中 国1990年以后，平均发病率在4. 08-10. 45万/10万之间，每年报告病例5. 1-12万例，近年 来多重耐药菌株的出现，使伤寒的抗生素治疗方法日益复杂，因此研究和使用疫苗无疑是 预防伤寒疾病的有效手段。
[0003] 之前虽然有伤寒灭活全菌体疫苗，但由于全菌体疫苗的菌体成分复杂，易产生不 良反应。现已有两种新一代的伤寒疫苗：口服Ty21a活疫苗和注射用伤寒Vi多糖疫苗。伤 寒Vi多糖疫苗于1994年在美国首先获得上市许可，因其含有纯化的伤寒杆菌Ty2株Vi荚 膜多糖，可引起T细胞非依赖性IgG为主的免疫应答，具有预防伤寒的作用。
[0004] 副溶血性弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌，存在于近海岸的海水、海底沉积物 及鱼类和贝类海产品中。人类进食该菌可能引起食物中毒，临床上以腹痛呕吐腹泻及水样 便为主，严重者可引起败血症。
[0005] 对于肠道细菌的荚膜多糖提取的方法，传统上主要是通过苯酚重复抽提去除菌体 蛋白质、乙醇沉淀去除菌体残留核酸等。其过程需要使用大量的苯酚，经超滤或透析去除残 余苯酚，而且苯酚对人体有伤害，使用后的废液对环境有污染。因此，寻找新的纯化工艺，提 高产品的质量是生物制药领域未来不断的发展方向，据第十届中国药典委员会细菌制品专 业委员2012年第三次会议内容，2015年修订版《中国药典》将新增订伤寒Vi多糖疫苗原的 内毒素标准和成品〇-乙酰基含量检定项。本发明本着国家及国际社会对生物制品的质量 指标不断提高的要求，在分析伤寒Vi多糖疫苗传统制备工艺技术的基础上，探索出放弃使 用苯酚抽提的新技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种操作更简单、易于产业化、环保，能避免对操作人员的伤 害、能快速提取高质量的针对肠道细菌的荚膜多糖的方法。
[0007] 为达到本发明目的，本发明通过以下技术方案实现：
[0008] -种针对肠道细菌的荚膜多糖提取方法，包括以下步骤：
[0009] (1)在肠道致病细菌发酵培养液中加入甲醛杀菌，离心去除菌体沉淀，收集培养液 上清；甲醛的加入量为：每升发酵培养液加入5?20毫升浓度为37 % (ml/ml)的甲醛溶 液；
[0010] (2)培养液上清中加入阳离子去垢剂，于20?25°C静置沉淀3?24h，离心收集沉 淀，阳离子去垢剂的加入量为：每升培养液上清加入0. 5?5克阳离子去垢剂；
[0011] (3)沉淀用浓度为0? 7?I. 5mol/L的盐解离；
[0012] (4)解离液用50-300KD的超滤膜或用中空纤维滤膜超滤得超滤液I，超滤所用的 注射用水的体积为解离液体积的5?10倍；或解离液用透析袋透析得透析液I ;或解离液 用凝胶过滤层析得层析液I;
[0013] (5)调节超滤液I或透析液I或层析液I的pH值为6. 5-8. 0后,在超滤液I或透 析液I或层析液中加入阳离子去垢剂，放置3?24小时，离心收集沉淀；阳离子去垢剂的加 入量为：每升超滤液I或每升透析液I或每升层析液I分别加入10?60克阳离子去垢剂，
[0014] (6)沉淀用pH值为6. 0-7. 5且浓度为0? 1?0? 5mol/L的盐解离，离心后收集上清 液；
[0015] (7)上清液用50-300KD超滤膜或用中空纤维滤膜超滤得超滤液II，超滤所用的注 射用水的体积为上清液体积的3?10倍；或上清液用透析袋透析得透析液II ;或上清液用 凝胶过滤层析得层析液II ;
[0016] (8)真空冷冻干燥超滤液II或透析液II或层析液II后即为提取的肠道致病细菌的 荚膜多糖。
[0017] 步骤（2)和（5)中所述的阳离子去垢剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵、 十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基氯化铵。
[0018] 步骤（3)和（6)中解离所用的盐包括但不限于1((：1、似(：1』&(：1 2、1%(：12或六1(011)3。
[0019] 步骤（1)所述的肠道致病细菌包括但不限于伤寒沙门氏菌，或副溶血性弧菌。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0021] 1、本发明通过两次使用阳离子去垢剂的浓度和两次使用盐浓度的差异，对阳离子 去垢剂的浓度采用先低后高进行调控，同时配合使用先高后低的盐浓度对提取多糖进行控 制，有效去除了菌体残留的核酸、蛋白、内毒素等杂质，最终所获得的针对肠道细菌的荚膜 多糖不仅符合《中国药典》（2010版）的要求，并且内毒素含量指标优于采用《中国药典》 (2010版）中伤寒Vi多糖疫苗按现有传统工艺提取的伤寒Vi多糖的质量指标要求。
[0022] 2、本发明方法不仅能去除伤寒Vi多糖、副溶血性弧菌荚膜多糖等针对肠道细菌 的荚膜多糖中的蛋白、核酸，且提取的荚膜多糖中内毒素杂质含量指标比现有传统工艺提 取的效果更优，与现有传统工艺相比，其多糖中内毒素含量能控制在4Eu/y g或以下。制得 的伤寒Vi多糖、副溶血性弧菌荚膜多糖等针对肠道细菌的荚膜多糖适用于制备伤寒Vi多 糖、副溶血性弧菌荚膜多糖等针对肠道细菌的荚膜多糖的参比品、标准品、制备伤寒Vi多 糖疫苗、伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗、副溶血性弧菌荚膜多糖疫苗，副溶血性弧菌荚膜多糖 蛋白结合疫苗等针对肠道细菌的荚膜多糖疫苗及多糖蛋白结合疫苗的原材料。
[0023] 3、本发明方法生产的荚膜多糖质量优、产量高，简化了《中国药典》(2010版）现有 传统工艺中制备伤寒Vi多糖的工艺流程，工序简化，减少操作环节及时间，步骤简单易行， 所需试剂及材料经济，成本低廉，提取效果好，易于产业化，平均每升发酵液的伤寒Vi多糖 产量提高约14. 75mg/L，。
[0024] 4、本发明方法环保，无苯酚的使用，避免对操作人员的伤害和环境的污染，表明本 发明新工艺具有明显的优势，更符合国家未来不断提高质量标准的要