减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及兽用生物制品领域，更具体地说，涉及一种减少抗草鱼呼肠孤病毒多 克隆抗体中非特异性抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性 结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白 就是抗体。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋 巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地 就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产 生的抗体就是多克隆抗体。
[0003] 草鱼出血病是严重危害草鱼鱼种的一种传染性疾病，该病使草鱼各器官、组织有 不同程度的充血、出血现象。草鱼出血病的病原体是呼肠弧病毒。目前，草鱼出血病用草鱼 出血病疫苗进行人工免疫预防。
[0004] 在我国兽用生物制品中检测草鱼出血病弱毒活疫苗是否污染其它外源病毒时会 使用到抗草鱼出血病毒的多克隆抗体，即使用多克隆抗体中和草鱼出血病毒后接种CIK细 胞，观察CIK细胞是否出现病变。CIK细胞是上皮样细胞，贴壁不太牢固；而常规方法制备 的多克隆抗体含有非常多的非特异性抗体，这些抗体不但能够抗培养中的血清、还能抗CIK 细胞碎片等等一系列物质。使用这种多克隆抗体中和草鱼出血病病毒后，接种CIK细胞会 导致细胞出现类似病毒引起的病变。因此，常规方法制备的多克隆抗体的效价较低。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种减少抗草鱼 呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种减少抗草鱼呼肠孤病毒多 克隆抗体中非特异性抗体的方法，依次包括以下步骤：
[0007] 2)米用分子筛层析初步筛分草鱼呼肠孤病毒；
[0008] 3)采用离子交换层析纯化草鱼呼肠孤病毒；
[0009] 4)制备兔抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体；
[0010] 5)去除抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中的非特异性抗体。
[0011] 本发明所述的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其中， 所述步骤2)中的分子筛层析采用Sepharose6fastflow凝胶柱；将草鱼呼肠孤病毒上样 至凝胶柱，以0. 005-0. 02mol/L，pH= 6. 0-8. 0的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集第一个洗 脱峰样品。
[0012] 本发明所述的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其中， 在所述步骤2)中上样前以0. 02-0. 03mol/L、pH= 6. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液平衡S印harose 6fastflow凝胶柱。
[0013] 本发明所述的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其中， 所述步骤3)中的离子交换层析采用的DEAE阴离子交换柱，将步骤2)中初筛的草鱼呼肠孤 病毒液上样至DEAE阴离子交换柱，以0. 1-1.OM的NaCl溶液进行洗脱。
[0014] 本发明所述的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其中， 在所述步骤3)中上样前0. 01-0. 3mol/L，pH= 6. 0-8. 0的TriS-HCl缓冲液平衡DEAE阴 尚子交换柱。
[0015] 本发明所述的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其中， 所述步骤5)包括如下步骤：
[0016] 51)将CIK细胞在Gibco的M199培养基上培养，待CIK细胞生长致密后，倒 掉Gibco的M199培养基，加入0. 2-0. 3 %胰酶，待CIK细胞消化好后，倒掉胰酶并加入 15-20mLPBS溶液吹散并回收CIK细胞，然后在1500-3000转/分钟离心10-30分钟，去上 清，加入15-20mLPBS溶液，-20°C反复冻融后8000转/分钟离心10-30分钟，去上清液，得 到CIK细胞碎片；
[0017] 52)在步骤51)得到的CIK细胞碎片中加入步骤4)中制备的草鱼呼肠孤病毒多克 隆抗体血清10mL，悬浮沉淀，37°C孵育Ih后8000转/分钟离心20分钟，收集上清溶液。
[0018] 本发明所述的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其中， 在步骤2)之前还包括采用膜包对草鱼呼肠孤病毒进行浓缩的步骤1)。
[0019] 本发明所述的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，其中， 所述步骤1)如下：将草鱼呼肠孤病毒液3000-6000转/分离心，离心时间为20-50分钟， 去掉草鱼呼肠孤病毒液中细胞碎片等大块物质，然后通过截留孔径为30-300K膜包进行浓 缩。
[0020] 实施本发明的减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法具有以 下有益效果：
[0021] (1)通过膜包对草鱼呼肠孤病毒进行浓缩，再利用分子筛、离子交换的方法进行 纯化，去掉培养液中85 %以上的杂蛋白，病毒能够回收64 %，提高了的滴度和纯度。其中， 膜包去除的是小于膜包孔径的蛋白质，同时具有浓缩的作用；而分子筛层析去除的是与草 鱼呼肠孤病毒在层析过程中能够很好分离开的蛋白质；而离子交换去除的是与草鱼呼肠孤 病毒带负电荷差异较大的蛋白质。
[0022] (2)通过制备的抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体与CIK细胞碎片结合，除去部分抗 草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中的非特异性抗体，减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中的部 分非特异性抗体，进而减少其对CIK细胞的毒性和提高其抗体效价。纯化的病毒目的是 减少多克隆抗体中的非特异性抗体，而兔血清的抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体具有抗CIK 细胞碎片等各种蛋白的非特异性抗体；使用纯化的草鱼呼肠孤病毒制备多克隆抗体和使用 CIK细胞碎片中和多克隆抗体中非特异性抗体等均是为了减低对CIK细胞的毒性和提高多 克隆抗体的效价。
【附图说明】
[0023] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0024] 图1是为草鱼呼肠孤病毒液通过Sepharose 6fast flow分子筛层析的分离效果；
[0025] 图2是为草鱼呼肠孤病毒液通过DEAE-葡聚糖离子交换层析的分离效果。
【具体实施方式】
[0026] 下面，结合附图以及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0027] 本发明提供一种减少抗草鱼呼肠孤病毒多克隆抗体中非特异性抗体的方法，依次 包括以下步骤：
[0028] 1)采用膜包对草鱼呼肠孤病毒进行浓缩：
[0029] 将草鱼呼肠孤病毒液3000-6000转/分离心，离心时间为20-50分钟，去掉草鱼呼 肠孤病毒液中细胞碎片等大块物质，其中，较佳的离心条件为3500-5000转/分，离心时间 应该大于30分钟；然后通过截留孔径为30-300K膜包进行浓缩，其中，截留孔径为最好小于 100K，得到浓缩的草鱼呼肠孤病毒液。
[0030] 2)米用分子筛层析初步筛分草鱼呼肠孤病毒：
[0031] 分子筛层析采用Sepharose6fastflow凝胶柱；上样前以0?02-0. 03mol/L、pH =6. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液平衡Sepharose6fastflow凝胶柱，具体地，以0. 025mol/L、 pH= 7. 0的磷酸盐缓冲液平衡Sepharose6fastflow凝胶柱；然后将步骤1)浓缩得到的 草鱼呼肠孤病毒液上样至凝胶柱，以0. 005-0. 02mol/L，pH= 6. 0-8. 0的Tris-HCl缓冲液 进行洗脱，具体地，以〇.Olmol/L，pH= 7. 0的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰样 品，即初步筛分的草鱼呼肠孤病毒液。
[0032] 3)采用离子交换层析纯化草鱼呼肠孤病毒：
[0033] 离子交换层析采用的DEAE阴离子交换柱，上样前以0.01-0. 3mol/L，pH=6.0-8.0 的Tris-HCl缓冲液平衡DEA