调节免疫应答的利记博彩app
【专利说明】调节免疫应答 政府权利
[0001] 在此描述的本发明是在由国立卫生研宄院授予的授权号R01A1079336下在美国 政府支持下完成的。美国政府在本发明中享有某些权利。 发明领域
[0002] 本发明的实施例涉及用于调节受试者的先天性和获得性免疫和/或用于免疫相 关失调、癌症、自身免疫的治疗，治疗并预防感染的组合物和方法。 背景
[0003] 对病原体入侵的细胞宿主防御应答主要涉及导致抗病原体基因的诱导的病原体 相关分子模式（PAMP)的检测，例如病毒核酸或细菌细胞壁组分（包括脂多糖或鞭毛蛋白）。 例如，病毒RNA可以通过存在于内质网（ER)和/或内涵体（例如TLR 3和7/8)中的膜结 合Toll-样受体（TLR)或通过TLR-依赖性细胞内DExD/H盒RNA解旋酶（称为视黄酸诱导 基因l(RIG-I))或黑色素瘤分化相关抗原5(MDA5,也称为IFIH1和helicard)检测。这些 事件在下游信号传导事件的激活中达到高潮，其中大部分仍是未知的，从而导致NF-kB和 IRF3/7-依赖性基因（包括I型IFN)的转录。 概述
[0004] 作为一种在先天性免疫应答中发挥关键作用的分子的STING(干扰素基因的刺激 物）包括5个主要位于内质网（ER)中的假定跨膜（TM)区，并且能够激活NF-kB和IRF3转 录途径两者从而诱导I型IFN并且在表达后发挥有效的抗病毒状态。参见美国专利申请序 列号13/057, 662和PCT/US 2009/052767。STING的缺失减少聚1C激活I型IFN的能力并 且使得通过靶向同源重组产生的缺乏STINGflffiF)的鼠类胚胎成纤维细胞易受水疱性口 炎病毒（VSV)感染。不存在STING的情况下，DNA介导的I型IFN应答被抑制，表明STING 可能在识别来自病毒、细菌及其他可以感染细胞的病原体的DNA中发挥重要作用。酵母双 杂交和免疫共沉淀研宄表明STING与RIG-I相互作用并且与Ssr2/TRAP 0相互作用，Ssr2/ TRAP 0是翻译后蛋白质跨越ER膜易位所需的易位子相关蛋白（TRAP)复合体的一个成员。 TRAP 0的RNAi消融抑制了 STING功能并且阻碍对聚1C应答的I型IFN的产生。
[0005] 另外的实验显示，STING自身结合例如来自病原体的核酸（包括单链和双链DNA) 及凋亡DNA，并且在调节炎性病症（例如DNA介导的关节炎和癌症）中的促炎基因表达中发 挥核心作用。在此描述了上调STING表达或功能的各种新方法和组合物，连同与STING相 互作用的其他细胞分子的另外的表征。这些发现允许用于调节免疫系统和其他系统的新辅 助剂、疫苗和疗法的设计。
[0006] 在此描述了用于调节罹患一种与异常STING功能相关的疾病或失调的受试者的 免疫应答的方法。这些方法可以包括向该受试者给予一定量的药物组合物的步骤，该药物 组合物包括一种调节STING功能的药剂和一种药学上可接受的载体，其中该药物组合物的 量有效地改善该受试者的异常STING功能。该药剂可以是一种增加或减小STING功能的小 分子，或一种在细胞内条件下结合至STING的核酸分子。该结合STING的核酸分子可以是一 种长度在40与150个碱基对之间的单链DNA或一种长度在40与150、60与120、80与100、 或85与95个碱基对之间或更长的双链DNA。该结合的STING核酸分子可以是耐受核酸酶 的，例如由耐受核酸酶的核苷酸构成。它还可以与一种协助跨膜转运的分子关联。在这些 方法中，该疾病或失调可以是一种DNA-依赖性炎性疾病。
[0007] 在此还描述了治疗罹患被炎性免疫细胞浸润的癌性肿瘤的受试者的癌症的方法。 这些方法可以包括向该受试者给予一定量的药物组合物的步骤，该药物组合物包括一种下 调STING功能或表达的药剂和一种药学上可接受的载体，其中该药物组合物的量可有效地 将浸润癌性肿瘤的炎性免疫细胞的数目减少至少50% (例如，至少50%、60%、70%、80% 或90%，或直到炎性细胞浸润的减少是通过组织学或扫描可检测地减少的）。
【附图说明】
[0008] 图1A-G示出了 STING依赖性先天性免疫信号传导。图1A :将人类端粒酶成纤维细 胞（hTERT-BJl)用不同核苷酸（3yg/ml)转染16h。测量内源性IFN0水平。将hTERT-BJl 细胞用FITC轭合的dsDNA90转染，通过荧光显微镜进行检查，以确保有效转染。图1B : 将hTERT-BJl细胞用模拟的、随机的或两个独立的人类STING siRNA(siRNA 3或4)转染 3天，随后dsDNA90转染（3yg/ml)16小时。测量内源性IFN0水平。通过免疫印迹展示 hSTING蛋白的沉默，用0-肌动蛋白作为对照物。图36C :将初级STING+'SnNG-^STATl- 或STATl+MEF用或不用dsDNA90 (3 y g/ml)转染3小时。纯化总RNA并且通过Illumina Sentrix珠粒芯片阵列（小鼠WG6版本2)检查基因表达。图ID :将hTERT-BJl细胞用NS 或 STINGsiRNA 处理。3 天后，将细胞用 dsDNA90、ssDNA90 或 ssDNA45(3yg/ml)处理。16 小时后，通过实时RT-PCR测量IFN0 mRNA水平。图1E :将hTERT-BJl细胞用NS或STING siRNA处理。在第3天，将细胞用dsDNA90、ssDNA90或ssDNA45 (3 y g/ml)处理。16小时 后，测量内源性IFN0水平。图1F :将初级STING+/+或STING^lffiF用或不用dsDNA90(3yg/ ml)转染。3h后，与图1C相同。图1G:将hTERT-BJl细胞用或不用dsDNA90(3yg/ml)处 理3小时并且用抗-HA抗体和作为ER标记物的钙网蛋白染色。
[0009] 图2A-J显示STING结合至DNA。图2A:将293T细胞用指定的质粒转染。将细胞 裂解物用生物素_dsDNA90琼脂糖沉淀并且使用抗-HA抗体通过免疫印迹进行分析。图2B : STING突变体的示意图。图2C:与图2A相同。图2D:与图2A相同。不能结合DNA的STING 变体标记为红色。图2E :将hTERT-BJl细胞用生物素轭合的dsDNA90 (B-dsDNA90 ;3 y g/ml) 转染6h并用DSS处理。将裂解物使用链霉亲和素琼脂糖沉淀并且使用抗-HA抗体通过免 疫印迹进行分析。图2F :在293T细胞中表达STING并且36小时后，在竞争者dsDNA90、聚 (I: C)、B-DNA或SSDNA90的存在下，用dsDNA90琼脂糖孵育裂解物并且使用抗-HA抗体通过 免疫印迹进行分析。图2G:将293T细胞用HA-标记的STING、GFP或TREX1转染。将细胞 裂解并且添加生物素标记的ssDNA或dsDNA与链霉亲和素琼脂糖珠粒。使用抗-HA抗体通 过免疫印迹对沉淀物进行分析。图2H :将293T细胞用IFN 0 -荧光素酶和STING变体转染 并且测量荧光素酶活性。图21 :将hTERT-BJl细胞用dsDNA90转染并且与甲醛交联。沉淀 STING并且使用dsDNA90特异性引物通过PCR检测结合的DNA。NC :阴性对照。PC :阳性对 照，dsDNA90。图2J :将STING+/+或STING 用dsDNA90转染并且然后与图21相同。误 差条表示标准差。数据表示至少两个独立实验。
[0010] 图3A-3H显示TREX1是STING信号传导的负调节物。图3A :免疫印迹确认在 siRNA 处理的 hTERT-BJl 细胞中 STING 和 / 或 TREX1 的敲低（knockdown)。图 3B :将 siRNA 处理的hTERT-BJl细胞用dsDNA90(3yg/ml)转染。16小时后，测量内源性IFN0水平。 *P〈0. 05。图3C :将siRNA处理的hTERT-BJl细胞用HSV-1 (m. o. i = 1)感染并且测量病毒 滴度。*P〈〇. 05。图38D :将siRNA处理的hTERT-BJl细胞用y 34. 5缺失的HSV感染并且 测量病毒滴度。*P〈〇. 05。图3E:NS或STING siRNA处理的TREX1+/+或TREX1+MEF的免疫 印迹确认STING敲低。图3F :将siRNA处理的TREX1+/+或TREX1 用dsDNA90处理并且 16小时后，测量IFN0水平。*P〈0. 05。图3G :将siRNA处理的TREX1+/+或TREX1 +MEF用 HSV-1 (m. o. i = 1)感染并且测量病毒滴度。*P〈0. 05。图3H :使用或未用dsDNA90转染的 hTERT-BJl细胞的抗-TREX1或抗-STING抗体的免疫荧光分析。*P〈0. 05,斯氏t检验。误 差条表示标准差。数据表示至少两个独立实验。
[0011] 图4A-J:显示TREX1与寡糖基转移酶复合体关联。图4A示出了 TREX1的示意图。 红色表示RPN1结合位点。图4B示出了 STING的示意图。红色表示DAD1结合位点。图4C : 在酵母双杂交分析（1. pGBKT7,2. pGBKT7-NFAR M9,3. pGBKT7-TREXl，4. pGBKT7-STING全长， 5. pGBKT7-STING C-末端）中，RPN1 与 TREX1 相互作用。图 4D:将 293T 细胞用 TREXl-tGFP 和RPNl-Myc共转染。将裂解物使用抗-Myc抗体免疫沉淀并且通过免疫印迹进行分析。图 4H :将hTERT-BJl细胞用或不用dsDNA90(3 y g/ml)处理。转染后第6h，使用抗-STING或 抗-DAD1抗体通过免疫荧光检查细胞。图41 :在蔗糖梯度离心后，使用指定的抗体对微粒