用于鱼类群落结构研究的环境dna鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生态学领域，特别涉及水体环境DNA的样品采集，DNA提取，引物 扩增以及条形码序列的物种鉴定方面，具体是指一种用于鱼类群落结构研宄的环境DNA鉴 定方法。
【背景技术】
[0002] 国内目前用于鱼类群落和种群生态学研宄的方法主要有捕捞法和声学探测法。捕 捞法是通过对水体中的鱼类进行捕捞，然后进行物种的鉴定、群落结构分析。该方法的实现 主要是通过各种捕捞工具和方法（如各种网具、钓具、电捕等）对于鱼类进行捕获而完成。 该方法存在以下几方面的问题：1、对捕捞强度要求高。需要通过大量的捕捞工作，人力、物 力、成本投入都较大。2、对于鱼类种群生物量较少且地形复杂的水体，各种捕捞方法对不同 生态类型的鱼类（表层鱼类、中下层鱼类、洞穴鱼类、底栖鱼类等）难以同时有效地进行捕 获，准确性难以保证。3、该方法需要捕获活体，上述捕捞方式难以保证被捕获鱼类的存活， 对于鱼类资源有一定的破坏。4、对于稀有物种、外来物种的监测调查由于其数量稀少，往往 难以取得良好的效果，调查结果更加容易产生偏差。
[0003] 声学探测法利用回声探测仪对各个水体的鱼类资源状况进行了评估。研宄通过回 声成像，并充分结合分层拖网的鱼类取样，进行积分分配，从而得到目标强度与鱼体长度 的换算关系式，最后估算水域鱼类资源量及分布，其结果相对捕捞法更为准确。然而该技 术还是要建立在捕捞的基础上，不仅存在上述的问题，该技术还受到水域理化指标和天气 状况的限制，而且对于大面积水域的调查仍有很大的局限性。同时，在物种鉴定方面，该方 法也无法实现准确有效的物种鉴定和群落结构的分析。
[0004] 环境DNA是指从有机体脱落释放进入到自然环境中（如空气、水、土壤等）的DNA， 包括细胞中的DNA和细胞破碎后游离出细胞外的DNA分子。环境DNA技术就是直接从水、 土壤、沉积物等环境样本中提取DNA片段，后通过DNA测序和qPCR等分子生物学检测技术 来定性或定量目标生物，从而确定目标生物在该环境中的分布及功能特征的研宄方法。环 境DNA的应用最早是从土壤、沉积物中直接提取出来DNA基因组，用来研宄微生物多样性以 及物种鉴定，后来在生态学的研宄中关于环境DNA的应用得到进一步的发展，逐渐从微生 物学拓展到了动植物学研宄领域中。由于水环境的特殊性，加上水生动物在水中的流动性、 易躲藏、不易捕捞等特点，在大面积的水域中有关水生动物方面的调查研宄往往费时费力 不易进行。但现在并没有一种系统的采用环境DNA技术来进行鱼类群落研宄的方法。
[0005] 所以一种能够高效、快捷、灵敏、准确的鉴定样品采集地点鱼类群落组成情况的方 法是十分具有实用性的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种能够高效、快捷、灵 敏、准确的鉴定样品采集地点鱼类群落组成情况的用于鱼类群落结构研宄的环境DNA鉴定 方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了一种用于鱼类群落结构研宄的环境DNA鉴定方 法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008] 步骤⑴：根据鱼类群落所在水域的大小，采集水样；
[0009] 步骤（2):将所述的水样进行处理后，提取其中的总环境DNA;
[0010] 步骤（3):将所述的总环境〇嫩采用核苷酸序列为3￡〇10勵：1和3￡〇10勵:2的 16srDNA序列作为通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0011] 步骤⑷：将所述的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有DNA的凝胶；
[0012] 步骤（5):将所述的带有DNA的凝胶进行切胶克隆测序后通过GENBANK或BOLD进 行blast比对，以确定所述的DNA是否为鱼类序列；从而确定物种及其组成比例，统计物种 数、多样性指数、优势度指数、物种丰富度等，同时利用聚类分析、主成分分析、多维尺度分 析等对于群落结构的相似度和差异进行统计。
[0013] 步骤（6):确定所述的DNA为鱼类序列后，采用二代测序技术对所述的PCR产物的 组成情况进行大规模分析，以确定环境中DNA的鱼群的组成和鱼类的群落结构。
[0014] 较佳地，所述的步骤（1)的采集水样为从需要调查的样点区域采集柱状水层的水 样后等体积混合。
[0015] 较佳地，所述的步骤（2)中的处理为对所述的水样采用3ym滤膜进行抽滤，抽滤 后将所述的滤膜放入无菌水中高速震荡l〇min，在5000转速下离心，收集沉淀后于-20°C保 存。
[0016] 较佳地，所述的步骤（2)中的处理为对所述的水样采用离心机在10000转速离心， 去上清液，加入l〇ml缓冲液，超速离心分离。
[0017] 较佳地，所述的步骤（2)中的处理为使用3ym滤膜抽滤，并收集所述的滤膜。
[0018] 较佳地，所述的步骤（2)中的提取为采用试剂盒提取所述的总环境DNA并溶于TE 缓冲液中于_20°C保存或采用酚氯方法提取所述的总环境DNA。采用的试剂盒为QIAGEN公 司生产的试剂盒QIAampDNAMicroKit(QiagenGmbH,Hilden,Germany)或者其他同类试 剂盒（如 1.试剂盒DNeasyBloodandTissueKit(QiagenGmbH,Hilden,Germany) ;2?试 剂盒PowerWaterSterivexDNAIsolationKit(MoBio，CA)等）
[0019] 较佳地，所述的步骤（3)中PCR扩增的反应条件为：4°C预变性2min，94°C变性 30s，52°C退火 40s，72°C延伸lmin，35 个循环，72°C延伸 10min;
[0020] PCR扩增的反应体系为每25ul体系中：2. 5ul10XPCRbuffer，2. 5mM浓度的 dNTP2ul，浓度为lOuM的正反引物各lul，5U/ul的Taq酶0. 15ul，DNA模板10ng，采用灭菌 水补足。
[0021] 较佳地，所述的凝胶电泳为取所述的PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶中，电压100V， 电泳45min，用溴化乙锭染色8min，最后在凝胶成像系统上拍照，并统计引物的扩增效果。
[0022] 较佳地，所述的步骤（6)中采用罗氏454测序平台对PCR产物的组成情况进行大 规模分析。按照每个样品数据量在1万条序列以上的要求，每个反应可以将80个样品同时 上机测序，采用8个碱基的barcode组合，形成80个不同组合的barcode，连接于每个样品 所使用的引物16sF和16sR中，从而区别一个反应中的不同样品。
[0023] 采用本发明的用于鱼类群落结构研宄的环境DNA鉴定方法，将环境DNA的技术原 理应用于调查研宄，在获取水体中的环境DNA时，只需在目标水体一定范围内进行水样的 采集，与传统方法相比，不需要进行大量的捕捞作业，也不会伤害鱼类个体。这样既可以节 省大量的人力财力，也保护了鱼类的种群。在物种鉴定的时候，只需要用筛选好的特有引物 进行扩增，然后进行测序，测序结果再与GENBANK、BOLD中物种基因进行比对就可以来确定 物种的种类。相对于传统的方法，不需要进行大量物种的外表鉴定，省时省力且准确。在稀