一种基于ssr基因型的果树品种区分及特征指纹展示方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学的分子标记领域，具体涉及一种基于SSR基因型的果树品 种区分及特征指纹展示方法。
【背景技术】
[0002] 近些年来，随着我国人民生活水平提高，土地流转加速，资本下乡日渐活跃，果树 产业获得了快速发展，大量优良的果树品种被应用于生产。建立一套简便、快速、可靠的果 树品种鉴定技术体系应用于果树品种鉴定，进行品种权利保护，对于维护育种者和生产者 的利益，保障果树产业健康发展，具有重要而现实的意义。
[0003] 传统的形态学品种鉴定方法无法有效鉴别大量的品种，分子标记技术的兴起与 应用，为植物品种鉴定提供了准确、可靠的技术手段。常见的分子标记有RAPD(Random AmplifiedPolymorphicDNA)、RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)、 ISSR(Inter-simp1esequencerepeat)、AFLP(Amp1ifiedFragmentLength Polymorphism)和SSR(SimpleSequenceRepeat)。
[0004]SSR也称微卫星、短串联重复（STR)，是由长度为1一6个碱基的基元，串联重复而 成的，广泛分布于基因组中。SSR是基因组中变异最为迅速的序列，其串联重复数的突变率 很高，从而产生了很多等位基因，形成了SSR的高度多态性。SSR标记是基于PCR扩增的分 子标记，较之基于分子杂交的RFLP标记和基于酶切位点的AFLP标记要简单、方便地多。与 RAH)和AFLP的随机引物标记不同的是，SSR标记呈共显性，引物由待检物种的基因组序列 开发而来，物种特异性强，不易受内生及外源微生物基因组的影响，结果准确可靠，较少的 引物组合可达到较高的检测精度。正是基于这些优点，国际植物品种权保护组织（UP0V)于 2007年将SSR与最新发展的SNP标记一起确定为构建DNA指纹数据库的标记方法。
[0005] 目前利用DNA标记进行果树品种鉴定的方法基本是聚类生成聚类图和指纹图谱， 也有在此基础上生成果树品种分子身份证的，但是不管哪种方法最终展示的内容都不含具 体的指纹数据信息，其他研宄者通常无法加以利用，更无法在此基础上进行内容上的充实， 致使许多物种至今没有可应用于实践的果树品种鉴定技术体系。因此，开发一种简便、快 速、可靠的果树品种鉴定新方法具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于开发一种利用SSR分子标记技术进行果树品种快速区分、鉴定 和特征指纹展示的方法。该方法较之常规的聚类图、指纹图谱和标准模式图，更为简便、直 观、真实，可方便地应用于果树品种区分、鉴定、查对和果树种质资源交换、管理、利用。更重 要的是品种特征指纹表的内容还可由其他研宄者进行不断地充实，其开放性更利于同行间 的交流和共享，从而能够群策群力整合尽可能多的资源，形成完善、实用的果树品种鉴定技 术体系。
[0007] 本发明提供一种基于SSR基因型的果树品种区分及特征指纹展示方法，包括如下 步骤：
[0008] 以等位基因数量多，多态性高，稳定性好为标准，筛选用于果树品种鉴定的SSR引 物。
[0009] 果树品种经PCR扩增，PCR产物经电泳检测后，按照"小分子量/大分子量"的格 式，统计果树品种在各SSR位点的基因型。
[0010] 将统计的基因型数据按照"品种名"和"SSR位点"录入数据处理软件整合处理，形 成果树品种SSR特征指纹数据表。
[0011] 对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，仅需对前一对SSR引物不能区 分开的品种继续进行SSR扩增和排序即可。
[0012] 进行相应果树品种鉴别时，只需按顺序考察比对SSR特征指纹数据表中相应SSR 位点的基因型数据即可。
[0013] 所述电泳检测为荧光毛细管电泳检测或PAGE胶检测。
[0014] 所述SSR位点的基因型为纯合基因型时，按照"分子量/分子量"的格式统计。
[0015] 所述数据处理软件为WPS或Excel表格。
[0016] 所述数据处理软件整合处理包括：
[0017] 新增一条"基因型数目"的记录，统计各SSR位点在果树品种中的基因型数目。
[0018] 利用表格的"数据一排序"功能，根据"基因型数目"由多到少以降序形式调整SSR 位点字段的排列位置，使基因型数目多的SSR位点排前面，少的排后面。
[0019] 将果树品种以某SSR位点为关键字排序，并标示SSR位点中唯一的基因型作为品 种区分，直至所有果树品种均被标示区分为止。
[0020] 若所有SSR位点均已排序仍存在不能区分的果树品种，整合处理终止，指示返回 增加SSR引物以进行区分，直至所有果树品种均被标示区分为止。
[0021] 将冗余SSR位点剪切到所有SSR位点之后，并去除标示。
[0022] 在最后两个标示位点区分的品种中对所有未标示的SSR位点进行重复项查找，将 未找到重复项的SSR位点剪切到这两个SSR位点之前，取代相应两个SSR位点，并标示。
[0023] 去除被取代的SSR位点的标示。
[0024] 重复上述步骤用以优化，以达到用尽可能少的SSR引物位点区分果树品种。
[0025] 所述SSR引物位点在果树品种中基因型数目的统计方法可利用表格中的函数公 式" =SUMPRODUCT(1/COUNTIF(某SSR位点基因型数据区域，某SSR位点基因型数据区 域"进行不重复统计或者利用表格中"数据一自动筛选"功能，在"内容筛选"栏统计所 列的该SSR位点不重复基因型数目。
[0026] 所述以某SSR位点为关键字进行排序，应按照各位点基因型数目权重，逐个SSR位 点或以3个SSR位点为单位分批进行，上一批位点排序后未区分的品种进入下一批位点排 序，直至所有品种都能被区分。软件版本许可时也可一次性完成排序，直至所有品种都能被 区分，具体步骤如下：
[0027] 利用表格的"数据一排序"功能，将所有果树品种以第一个SSR位点为关键字，按 升序排序。
[0028] 根据排序结果，将第一个SSR位点中唯一的基因型数据标示背景颜色或者字体加 粗显不，表明相应果树品种被区分出来。
[0029] 将第一个SSR位点基因型相同而不能区分的果树品种，再以第二个SSR位点为关 键字，按升序排序。
[0030] 根据排序结果，将第二个SSR位点中参与排序部分唯一的基因型数据连同相应品 种在前面SSR位点的基因型数据标示背景颜色或者字体加粗显示，表明相应果树品种被区 分出来。
[0031] 按以上步骤依次排序，直到所有果树品种均被标示背景颜色或者字体加粗显示区 分出来为止。
[0032] 所述冗余SSR位点为标示背景颜色或者字体加粗显示的基因型均为非唯一基因 型的SSR位点。
[0033] 所述重复项查找是限制在最后2个标示背景颜色或者字体加粗显示的SSR位点区 分的品种间进行，通过表格的"数据一重复项一高亮显示重复项"功能，对标示背景颜色或 者字体加粗显示的倒数第三个SSR位点具有相同基因型的品种对应的所有未标示背景颜 色或者字体加粗显示的SSR位点进行重复项查找。
[0034] 所述标示背景颜色或者字体加粗显示的基因型数据即为区分相应品种的特征指 纹数据，在表格所涉及的品种范围内仅用特征指纹数据即可区分和鉴定相应品种。
[0035] 所述对没有指纹数据的果树品种进行SSR标记区分时，无需执行依据基因型数目 调整SSR位点的排列位置。
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