检测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱的利记博彩app
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2009年12月22日，申请号为200980157313. 5,发明名称为"检 测等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型分析谱"的中国发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2008年12月22日提交的美国临时专利申请号61/140, 063、2009年 4月2日提交的美国临时专利申请号61/166, 188和2009年8月4日提交的美国临时专利 申请号61/231，232的优先权，它们全部内容通过参考的方式结合至本文。
技术领域
[0004] 本发明属于检测两种个体混合物中等位基因、基因组和转录物组的方法和基因型 分析谱领域。
【背景技术】
[0005] 产前诊断方法的主要目标是获得胎儿或胚胎的遗传信息。在临床实践中使用的 产前遗传诊断方法主要涉及侵入性技术，如羊水诊断、绒毛膜绒毛取样和胎儿血液取样或 活组织检查。那些技术涉及直接从胎儿或间接从雌性生殖结构中获取样品。由于那些方 法的高度侵入性性质，它们易于对母体或胎儿引起并发症。可以在羊水诊断情况下引证 的这样的并发症的例子是感染的风险、伴随可能的异源免疫的胎儿-母体出血、羊水损失 和腹痛。不同的研究已经评估羊水诊断后流产风险是0.06% -2. 1%，高于对照组的风险 (Eddleman，ObstetGynecol2006108 (5): 1067-1072)。结果，羊水诊断仅被推荐给那些生 产具有临床上显著的遗传变异的孩子的风险高于医源性流产的风险的女性，并且许多内科 医生更喜欢引证与他们的经验相当的风险（代表性地1/300-1/500)。
[0006] 为了限制引起上述并发症风险和通常是令人厌恶和/或成为母亲压力来源的侵 入性产前诊断技术的使用，非侵入性方法的发展构成了现代产科学的主要目标。
[0007] 特别是，在母亲血液中循环的胎儿细胞构成了作为产前遗传诊断潜在应用的遗传 物质来源（Bianchi，BrJHaematol1999105:574-583 ;Fisk，CurrOpinObstetGynecol 199810:81-83)。在怀孕期间，胎儿来源的不同细胞类型穿过胎盘并在母亲血液中循环 (BianchijrJHaematol1999105:574-583)。这样的细胞类型包括淋巴样细胞和类红细 胞、髓系前体和滋养层上皮细胞（细胞滋养层和合胞滋养层）。
[0008] 已经描述了以产前诊断为目的的用于分析在母亲血液中循环的胎儿细胞的 基因组的方法，但是它们仍然相对地限制了诊断的灵敏度和特异性（DiNaro等，Mol HumReprod20006:571-574;Watanabe等，HumGenetl998102:611_615;Takabayashi 等，PrenatDiagn199515:74-77;Sekizawa等，HumGenet1998102:393-396)。开发非侵 入性的高度特异的产前诊断方法的优势来自于使用其以减少在最终该结果是阴性的孕妇 中实施的侵入性诊断方法的比例的可能性。作为例子，在21三体情况下（涉及1/700女 性），在法国，通常仅当母亲是38岁时才提供产前诊断，而能够检测60%的21三体病例、 价格是羊水诊断价格的5%的生化分析实验被推荐给较年轻的女性。但是，40%的21三体 病例不能由目前可利用的实验检测出。已经描述了使用FISH技术在分离自母亲血浆的胎 儿细胞中进行21三体的产前检测。这个方法是有趣的，但是由于胎儿细胞在血浆中很少 (1/500-1/2000)并经常包括凋亡细胞，可靠的诊断将需要在非常大量的细胞上实施所述方 法，导致其不能常规地完成。此外，整倍体胎儿细胞不能通过该方法鉴别。
[0009]该方法的一个局限性源自于在血液中循环的胎儿细胞以非常低的浓度存在。基于 没有提前挑选的血液样品中Y染色体的PCR检测的研究已经确定要被检测的胎儿细胞的 平均数是大约每毫升血液1个胎儿淋巴细胞（Bianchi，JPerinatMed199826:175-85)。 最近，由于改进的富集技术产生更多细胞，该胎儿细胞的平均数已经向上修订。一个新 近的研究发现平均值是每毫升血液37个胎儿淋巴细胞（Huang,PrenatalDiagnosis 200828:892-899)〇
[0010] 因此，需要改进检测胎儿细胞等位基因和胎儿遗传变异的方法和手段。
【发明内容】
[0011] 本发明的实施方式涉及检测胎儿等位基因和胎儿遗传变异的方法和基因型分析 谱。本发明的一个实施方式是一种检测胎儿标识符的方法，包括：获得包含母本细胞和胎儿 细胞混合物的样品；将所述样品分成子样品；筛选或基因型分析子样品中胎儿标识符的存 在；及从至少一个子样品的胎儿细胞中鉴定至少一个胎儿标识符的存在。
[0012] 本发明的实施方式可以和可能包括以下的一种或多种：一种方法，进一步包括在 至少一个子样品上实行子样品扩增以提供扩增产物；一种方法，进一步包括将扩增产物分 成等份，其中筛选或基因型分析子样品中至少一个胎儿标识符的存在包括筛选等份中胎儿 标识符的存在；一种方法，其中子样品扩增包括一种选自以下方法的方法：全基因组扩增、 全转录物组扩增、目标核酸扩增、非胎儿标识符的核酸序列的扩增、核酸序列代理（proxy) 的产生和细胞分裂；一种方法，其中预扩增包括全基因组扩增或全转录物组扩增；一种方 法，其中预扩增包括目标核酸扩增、非胎儿标识符的核酸序列的扩增、核酸序列代理的产生 和细胞分裂；一种方法，进一步包括测定母本细胞的遗传物质在一系列目标基因座上是纯 合的或杂合的，以测定母本基因型，其中筛选或基因型分析等份或子样品中胎儿标识符包 括筛选或基因型分析等份或子样品中在至少一个目标基因座上不同于母本基因型的基因 型，其中不同于母本基因型的基因型的存在显示了在扩增的产物中提供信息的父本等位基 因的存在，和其中鉴定至少一个胎儿标识符的存在包括在至少一个等份或子样品中鉴定提 供信息的父本等位基因；一种方法，进一步包括在测定母本细胞的遗传物质是纯合的或杂 合的之前选择目标基因座；一种方法，进一步包括从目标基因座中选择实验基因座，其中筛 选包括筛选等份中实验基因座上不同于母本基因型的基因型；一种方法，其中实验基因座 的选择包括筛选混合的母本核酸和胎儿核酸的样品中在目标基因座上不同于母本基因型 的基因型，并在混合的母本核酸和胎儿核酸的样品中选择具有非母本基因型的目标基因座 作为实验基因座；一种方法，进一步包括分析被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的等 份或子样品以检测遗传变异；一种方法，进一步包括采集一部分被鉴定为含有提供信息的 父本等位基因的等份或子样品，其中分析被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的等份或 子样品以检测遗传变异包括分析采集的部分等份或子样品；一种方法，其中采集的部分是 等份或子样品的同质部分；一种方法，其中采集的部分是等份的非同质部分；一种方法，进 一步包括在分析扩增的产物之前从至少两个子样品中采集被鉴定为含有提供信息的父本 等位基因的等份并合并等份；一种方法，其中遗传变异是选自染色体重排、拷贝数变异和多 态性的胎儿遗传变异；一种方法，其中分析包括测定包含提供信息的父本等位基因的等份 中母系遗传的等位基因和父系遗传的等位基因的比例，分析所述比例以测定遗传变异的存 在；一种方法，其中分析包括测定包含提供信息的父本等位基因的等份中等位基因的拷贝 数，分析等位基因的拷贝数以测定遗传变异的存在；一种方法，进一步包括从至少两个子样 品中分析被鉴定为含有提供信息的父本等位基因的扩增产物以检测嵌合性或异卵双胞胎 的存在；一种方法，其中分析的等份或子样品不是筛选或基因型分析胎儿标识符的存在的 等份或子样品，而是来自于与作为筛选或基因型分析胎儿标识符的存在的等份相同的子样 品；一种方法，其中所述目标基因座对于母本基因型全部是纯合的，对于母本基因型全部是 杂合的，或者包含对于母本基因型的纯合基因座和杂合基因座的混合物；一种方法，其中所 述目标基因座对于母本基因型全部是纯合的；一种方法，其中扩增的产物包括基因组DNA 或互补DNA;-种方法，其中测定母本基因型包括使用SNP谱以基因型分析母本遗传物质的 样品，其中母本遗传物质来自作为母本细胞来源的同一个个体；一种方法，其中母本遗传物 质的来源选自血液、血清、血浆、尿液、宫颈拭子、眼泪、唾液、口腔拭子或皮肤；一种方法，其 中母本遗传物质的来源选自血液或口腔拭子；一种方法，其中母本核酸和胎儿核酸的混合 物是无细胞核酸混合物；一种方法，其中母本和胎儿无细胞核酸样品的来源是孕妇的血液、 血清、血浆、尿液、宫颈拭子、宫颈灌洗、子宫灌洗或后穹窿穿刺；一种方法，包括在单一等份 或子样品中选择和筛选或基因型分析多于一个实验基因座，在多于一个等份或子样品中选 择和筛选或基因型分析多于一个实验基因座，或在多于一个等份或子样品中选择和筛选或 基因型分析一个实验基因座；一种方法，包括在第一等份或子样品中鉴定提供信息的父本 等位基因之后，在至少第二子样品中选择和筛选或基因型分析第二目标基因座；一种方法， 其中划分所述样品以产生具有细胞泊松分布或非泊松分布的子样品；一种方法，其中每一 个子