β-丙氨酸的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β -丙氨酸的合成方法。
【背景技术】
[0002]β-丙氨酸(β-alanine)，即3-氨基丙酸(3_aminopropanoic)，是自然界中唯一存在的β型非蛋白氨基酸，丙氨酸作为一种重要的生化原料，其在医药、饲料以及食品领域都有着十分广泛的应用。
[0003]现有技术中，国内外企业主要以化学合成法生产丙氨酸，如丙烯腈法、氨基丙腈法以及琥珀酰亚铵降解法，但是，采用上述的化学合成法生产β -丙氨酸时会环境的污染较为严重，特别采用含腈原料，对环境及生物体都有极大的毒性。
[0004]为了克服上述技术缺陷，经研宄报道，目前已有多家企业采用生物合成法生产β -丙氨酸，比如:使用藤黄八叠球菌将丙烯酸转化为β -丙氨酸，β -丙氨酸的转化率为54%左右；选用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主表达来源于大肠杆菌的L-天冬氨酸-α羧化酶；另外，中国文献公开了一种名称为“一种生物催化合成β -丙氨酸的方法”的发明专利(公开号为CN102851333A)，该发明专利公开的技术方案是以富马酸为底物采用含酶的大肠杆菌细胞进行酶催化生产丙氨酸，但是该方法不仅工艺条件复杂，转化率低，而且生产周期长，副产物较多。
[0005]由此可见，现有技术生产丙氨酸的方法要么对环境污染严重，要么就是存在丙氨酸转化率低，生产周期长等缺陷，因此，如何提高丙氨酸的转化率，实现丙氨酸的低污染、高效率生产，还有待研宄人员的深入研宄。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种生产清洁、转化率高的β -丙氨酸的制备方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种β -丙氨酸的合成方法，其步骤如下:
[0008]a)配制底物:向酶反应器中投入L-天冬氨酸底物溶液；
[0009]b)酶催化反应:向底物溶液中加入含酶菌液进行催化反应，反应过程中分批次加入适量L-天冬氨酸以控制反应物的pH在5.0-9.0内，所述含酶菌液由高产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌经发酵培养、浓缩、破碎后得到；
[0010]c)将酶反应器中的反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β -丙氨酸。
[0011]采用上述技术方案产生的有益效果在于:1.采用含酶菌液进行生物催化反应使L-天冬氨酸一步法转化为β-丙氨酸，该方法清洁环保；2.目标产物的转化效率高，经试验验证，采用本申请公开的技术方案使得丙氨酸的转化率高达99.5%，因此该方法可以进行大规模的工业推广应用；3.目标产物的产能高，所述的高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌是由中国科学院微生物研宄所研发，详细信息可参见该单位申请的名称为“一种高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产丙氨酸中的应用”的发明专利(专利号为CN201310534782.2)，另外，关于高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌的发酵培养、浓缩、破碎以获取所述的含酶菌液的步骤，其可以直接采用常规的菌体发酵处理方法即可，具体的，也可以参见申请人于该申请同日提交的名称为“菌体细胞的破碎方法”的申请专利，具体的，该发明专利中记载的破碎后得到的菌体细胞液即为本申请所述的原料含酶菌液。
[0012]作为进一步的方案:所述步骤a是向酶反应器中投入水和L-天冬氨酸配制成浓度为5g/L-80g/L的底物溶液，用碱化剂调pH为5.0-8.5 ;所述步骤b中的高产L-天冬氨酸α-脱羧酶的工程菌为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌工程菌中的一种；所述步骤b中的含酶菌液是由大肠杆菌或枯草芽孢杆菌工程菌经发酵培养、浓缩、破碎后得到，其中发酵培养条件为:通气量 0.5vvm，转速 250rpm，温度 25°C _35°C，pH 为 6.0-8.5。
[0013]所述步骤b中的催化反应是采用流加酶法为N个阶段进行:阶段一至N分别向酶反应器中加入多5% (按重量百分比)含酶菌液进行催化反应，每阶段反应超过2h。当然，在催化反应的各阶段，需要分批次向酶反应器中加入适量的L-天冬氨酸，以确保反应物的PH值保持在5.0-9.0之间。具体的，采用上述技术方案主要有以下几个方面的优点:第一、与一次性投入含酶菌液相比，采用流加酶法向酶反应器中加入含酶菌液可以有效提高酶的利用率以及β -丙氨酸的转化率；第二、整个催化反应过程只需定期添加L-天冬氨酸以调节反应物的PH值即可，无需加入其他酶活调节剂、诱导剂等，这样一方面可以减小副产物的生产，另一方面也可以有效降低后序处理压力；第三、采用上述的生产方法只需在常压下进行即可，且温度条件温和，操作简单，可进一步降低生产成本。
[0014]更为具体的方案:所述步骤b中的催化反应是采用流加酶法，为N个阶段进行:将含酶菌液按重量配比称量分成N份，阶段一至阶段N分别向酶反应器的底物溶液中至少加入重量百分比5%的含酶菌液进行催化反应，每阶段反应均超过2h，所述的N ^ 2 ;所述步骤b中催化反应温度为20°C -65°C ;所述的碱化剂为氢氧化钠、氢氧化钾或者氨水中的一种。总体上来说，对于催化反应初期，转化反应的速度较快，因此反应温度可以适当偏低，后期L-天冬氨酸的转化反应速度相对较慢，因此可以适当升高至反应温度以加快反应速度；
[0015]进一步的，所述步骤c中的过滤处理是将反应物先通过微滤处理，再将微滤透析液进行超滤处理，得超滤透析液，其中微滤膜元件的孔径为20nm-200nm，超滤膜元件的孔径为lnm-50nm。所述的反应物过滤处理条件为:过滤温度为35°C _45°C，进出口压差为0.1Mpa-0.3Mpa。通过微滤处理即可除去其中的大分子蛋白杂质，然后再将微滤透析液进行超滤处理，因前道的微滤处理已除去其中的大分子蛋白杂质，因此微滤透析液能够快速通过超滤膜元件，同时除去其中的胶体杂蛋白以及糖类物质，这样得到的超滤透析液再经过脱色和结晶处理，即得产品。另外，所述步骤c中的脱色处理是采用活性炭脱色，脱色时间为20min-120min，温度为50°C _80°C，活性炭重量添加量是过滤透析液的0.5% -1% ;所述步骤c中的结晶处理工艺为:初始温度为60°C -80°C，每小时温度下降5°C -10°C，转速50rpm-100rpm。关于脱色步骤，是在超滤透析液中加入活性炭，经搅拌脱色后，采用板框过滤即可除去其中的活性炭。
【具体实施方式】
[0016]以下通过1-3实施例对本发明公开的技术方案作进一步的说明:
[0017]实施例1: β -丙氨酸的制备
[0018]a)配制底物:准备一容积为20m3的酶反应器，先向酶反应器中投入15m 3水，然后通过气流输送设备输入300kg的L-天冬氨酸配制成浓度为20g/L的底物溶液，投入氢氧化钠至PH为7.0，搅拌；
[0019]b)酶催化反应:分三个阶段进行，阶段一向酶反应器中加入0.2m3含酶菌液，在30°C -35 °C条件下进行催化反应4h ;阶段二向酶反应器中加入0.2m3含酶菌液，在35°C _45°C条件下进行催化反应4h;阶段三向酶反应器中加入0.2m3含酶菌液，在40°C _55°C条件下进行催化反应4h，其中，所述含酶菌液也就是申请人于该申请同日提交的名称为“菌体细胞的破碎方法”的发明专利记载的破碎后的菌体细胞液；反应过程中分批次加入适量