水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法、应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术中的基因克隆、基因表达、功能鉴定技术领域，具体涉及水稻抗病基因OsSehl及克隆方法、功能鉴定方法。
【背景技术】
[0002]水稻(Oryza sativa)是世界性重要的粮食作物[1]，也是谷类生物学的模式植物[2’3]。纹枯病(Rice sheath blight)是世界性水稻(Oryza sativa)三大病害之一，其发生面积广，危害程度重，严重影响水稻的产量和品质[1]。至今在水稻种质资源中尚未发现对水稻纹枯病完全免疫或高抗的水稻品种。纹枯病由真菌引起，从水稻秧苗期到抽穗期均可发病，侵染包括叶鞘、叶片、甚至穗子在内的各种组织，造成结实率下降[2]。水稻对纹枯病的抗性属于典型的数量性状抗病性，不存在主效抗病基因[3]。因此，研宄水稻对纹枯病广谱抗性的分子机理非常重要。目前，水稻广谱抗病相关的分子机理研宄主要集中在几丁质酶基因上，如许多研宄表明水稻植株中过表达几丁质酶或将几丁质酶基因和葡聚糖基因一起转入水稻可以破坏纹枯病病原菌细胞壁结构，从而提高植株抗性[4_9]。
[0003]近年来，越来越多研宄表明植物体的非特异性防御反应涉及多种核质运输的参与，不同的R蛋白(Resistance proteins)在运输途径中起重要作用。在水稻中已初步分离鉴定到了 NBS-LRR类的R蛋白抗病基因家族[1°]，但其功能尚未被验证。此外，真核细胞中蛋白质和RNA在细胞质和细胞核中的运输主要通过核孔蛋白复合体(NPCs)进行。植物体的防御反应被激活时，NPCs可以特异调节NB-LRRR蛋白、免疫原件及相关转录调控因子和丝裂原活化蛋白激酶细胞膜上的转运，转入细胞核，使植物启动抗病反应[11]。植物核孔蛋白(Nup)是NPCs的重要组成部分。尽管Nups在动物免疫过程中起重要作用早已被证明[[12’13]，然而，关于Nups参与许多植物的抗性调控因子转运的研宄尚少，已鉴定的Nups也非常少。
[0004]在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已发现了一个核孔编码蛋白的基因，AtSehl (GenBank登录号AEE34229)，其产物是核孔蛋白复合体Nupl07_160D的组成部分。它不能够直接对病原微生物进行作用，但可以特异性的识别TNL(Tollinterleukin lreceptor/nucleotide-binding/leucine-rich repeat)类抗性蛋白，从而参与植物SAR(systemic acquired resistance)反应，通过调节植物免疫调节因子EDSl (enhanced disease susceptibility I)的含量以及控制抗性蛋白的运输参与到水杨酸抗病途径中[14’15]。目前，水稻中已克隆的抗病基因中大部分基因编码类受体类蛋白激酶(Receptor-like protein kinase, RLK)，直接参与对病原菌的识别和防御，如Pi2，X21等[16，17]，而关于Nup的研宄较少。迄今为止，水稻Sehl基因的研宄未见报道。因此，对水稻中Sehl基因进彳丁克隆和功能研宄具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明提供水稻抗病基因OsSehl、克隆方法、功能鉴定方法、应用，填补水稻Sehl基因研宄的空白。
[0006]本发明采用的技术方案是，
[0007]水稻抗病基因OsSehl，其核糖核酸分子序列信息计算机可读版本是:
[0008]ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCGTCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGC AGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。
[0009]所述水稻抗病基因OsSehl的克隆方法，按照以下步骤具体实施:
[0010]步骤一、材料的准备
[0011]水稻品种‘中花11’用于转化过表达及RNAi载体，并作为水杨酸处理的阴性对照；水稻品种‘日本晴’用于RNA提取；还准备大肠杆菌DH5 α、农杆菌Η1105、立枯丝核菌株；
[0012]步骤二、水稻基因OsSehl的克隆
[0013]以拟南芥序列进行BLAST，搜索到‘日本晴’水稻基因组中与其同源性最高的基因序列(ΝΡ_001043597，Gene ID:4326622)，命名为 OsSehl，其 CDS 全长为 972bp，编码 323 个氨基酸，用Primer 5.0设id对特异性引物Seh-F
[0014](5' -TATGGTACCATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGA-Sr )和 Seh-R
[0015](5' -GCTCTAGACTAGTGAGACACATTGCAGTC-3')，分别加上 KpnI 和 XbaI 两个酶切位点，用以扩增OsSehl基因全长，同时设计另一对特异性引物mirF
[0016](5, -CGGATCCATGGTTACTGCATACTCAGATGG-Sr )和 mirR
[0017](5' -CGTCGACCTGAGGTGAGCCAAGCTCAA-3')，分别加 BamHI 和 SalI 酶切位点，用以扩增RNA干涉片段；
[0018]取日本晴三叶期的水稻幼苗，Trizol试剂法提取总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板，扩增OsSehl基因的PCR反应体系为:2.0mmoI/L的MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.25 μ g模板cDNA、I μ mol/L上下游引物、IU Taq酶，反应体系总体积25 μ 1，PCR反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s、60°C复性30s、72°C延伸lmin，进行32个循环；72°C总延伸lOmin，PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，进行TA克隆，载体为pEASY_Tl。
[0019]水稻抗病基因OsSehl的功能鉴定方法，按照以下步骤具体实施:
[0020]步骤一、过表达载体与RNAi载体构建及转化
[0021]测序正确的OsSehl基因全长，以pl301a载体为骨架，构建过表达载体0sSehl-pl301a，干涉片段与pUCCRNAi载体用BamHI/Bglll、Sall/Xhol两对同尾酶进行酶切，T4连接酶连接，构建双向插入片段的干涉重组质粒2Sehl-pUCC，用PstI单酶切验证，验证正确的2Sehl-pUCC质粒与pl301a载体用Sail、PstI双酶切，T4连接酶连接，构建干涉融合表达载体2Sehl-pUCC-pl301a，构建好的载体验证正确后经农杆菌介导转化水稻品种中花11，通过⑶S染液对转基因植株根和叶进行染色，显蓝色的为阳性植株，过表达载体上带有潮霉素抗性筛选标记基因，设计引物hyF(5' -ACTCACCGCGACGTCTGT-3r ),hyR(5/ -TTTCTTTGCCCTCGGACG-Sr )对转基因植株潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1009bp大小片段为阳性植株；
[0022]步骤二、亚细胞定位载体构建、转化及观察
[0023]设计引物sF (5' -AACTAGTATGGCGGAGCGGCAGGTG-3')，
[0024]sR(5' -TACCCGGGGTGAGACACATT
[0025]GCAGTC-3')，将OsSehlCDS序列的终止子切除，两端分别加上SpeI和SmaI酶切位点测序正确后，连接到P1305.1-GFP载体，酶切验证正确，电转法导入农杆菌EH105得到转化子，将转化子注射到烟草中，以注射携带空载体1305.1-GFP的EH105菌株作为阴性对照，注射后的烟草进行暗培养，36h后，在离注射孔Icm左右处剪取0.5cm2大小烟草叶片，制片后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位；
[0026]步骤三、OsSehl水杨酸诱导表达分析
[0027]生长到株高15cm左右的野生型日本晴幼苗用5mmol/L水杨酸叶面喷洒处理，分别在处理后的0、12、24、36、48和72h取样，Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，对OsSehl基因进行荧光定量PCR试验，观察水杨酸处理后该基因在不同时间段的表达水平，实验采用水稻Actin作为内参基因，每个样本重复测量3次，结果以2_λλ 1直表示基因表达的相对值，以3个样本测定结果的平均值作为最终结果，荧光定量PCR的Sehl和Actin引物分别如下:SehlF
[0028](5, -CAGATGGCCAAGTGAAGGTTTAT-3, )，SehlR
[0029](5, -GTTCTGGAACTCCGCCTGAA-3')；
[0030]ActinF (5' -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3' )，ActinR
[0031](5, -GTACCCGCATCAGGCATCTG-3')；
[0032]步骤四、OsSehl转基因植株体内水杨酸含量测定及抗病性鉴定利用高效液相色谱，对转基因植株以及对照植株叶片中自由态水杨酸含量进行测定；根据峰面积所占的比例，分别计算出对照与过表达植株T1-1/2/3以及RNAi植株体内游离态SA的含量，每组实验重复3次，采用牙签嵌入接种法对过表达植株、干涉植株、对照中花11野生型植株分别进行纹枯病病原菌接种，重复2次，每次各接种15株，利用加湿器和温室，控制温度在35°C左右及湿度90 %以上的条件下生长，15天后对水稻病菌侵染症状进行观察统计，按病斑面积占叶鞘总面积的比例来判定植株的感病情况。
[0033]进一步，步骤四的游离态SA的含量的计算，实验数据均用SPSS统计软件处理和统计分析，方法为单因素方差分析，p<0.05为差异显著，p>0.05为差异不显著。
[0034]水稻抗病基因OsSehl应用于水稻纹枯病的防治。
[0035]本发明的有益效果是:克隆了日本晴水稻中的编码核孔蛋白的基因OsSehl，完成氨基酸序列分析、亚细胞定位、水杨酸诱导表达及转基因植株的抗病性鉴定，初步明确了OsSehl基因在水稻抗病中的功能，为水稻广谱抗病分子机理和水稻广谱抗性品种分子育种提供理论基础。
【附图说明】
[0036]图1本发明的2Seh-pUCC_pl301a构建流程示意图；
[0037]图2本发明的水稻遗传转化流程图；
[0038]图3本发明的pl305.1-GFP载体图谱