一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法，属于蛋白纯化
技术领域。
【背景技术】
[0002] 大豆具有丰富的必需氨基酸组分，是人和畜禽的优质植物性蛋白源，具有很高的 营养价值，此外，大豆蛋白还具有优越的加工性能如乳化性和起泡性等，以及良好的生理功 能，能降低胆固醇、减少患心脏疾病的危险等。随着大豆蛋白分离技术的改进，大豆蛋白作 为营养性和功能性成分得到了广泛的应用，以大豆蛋白为基础的加工食品是目前食品工业 中增长最快的一类。但是，大豆蛋白也是八大类主要致敏原之一，全球有近〇. 3% -0. 4%的 人口对大豆过敏。研宄发现，约有0. 3%-0. 4%的婴幼儿会对大豆蛋白过敏，而且随着大豆 蛋白制品被广泛使用，成人对大豆蛋白过敏的发病率也在不断地攀升。大豆过敏症状表现 出多种不同形式，常见的包括湿瘆、过敏性皮炎和哮喘等。此外，大豆蛋白作为动物饲料的 主要蛋白源，其致敏成分会损伤动物肠道，不利于动物的生长。
[0003] 大豆蛋白分为15S球蛋白、11S球蛋白、7S球蛋白和2S球蛋白，其中11S球蛋 白和7S球蛋白约占大豆蛋白总量的70%。伴大豆球蛋白是7S组分的主要成分，由 a'（76kDa)，a(72kDa)和0 (52_54kDa)亚基组成的分子量为150kDa的三聚体化合物，约 占大豆蛋白总量的20%-30%。Ogawa等按照致敏能力和蛋白含量，把GlymBd60K、Gly mBd30K和GlymBd28K作为主要大致敏原。GlymBd60K即0-伴大球蛋白的a 亚基，是一种糖蛋白，可被25%左右的大豆敏感患者的血清识别。Krishnan等发现Glym Bd60K、a'亚基和0亚基都是能引发大豆过敏反应的潜在致敏原。引起过敏反应的过敏 原阈值水平通常很低，很少量的致敏原就足以引发过敏反应。据报道，大豆致敏原阈值水平 范围一般为0. 0013-500mg。因而，如何有效降解大豆蛋白中的过敏原就成为了一个必须解 决的问题。
[0004] 当前对酶解法降解大豆蛋白过敏原的研宄中利用的酶都集中于商品化的酶，很少 有针对降解大豆过敏原而筛选得到的菌株及其产酶的分离纯化的研宄。虽然现已从降解大 豆过敏原为出发点筛选得到了一株能够降解其的野生菌，但是由于没能从该菌株产物中分 离纯化得到其中能够降解大豆过敏原的酶，从而对该酶的认识却是少之又少。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种能够降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的纯化方法。该蛋白酶来源 于一株可降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌。
[0006] 所述芽孢杆菌保藏中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCCM2012165,分 类学命名为Bacillussp.BBE201108〇
[0007]所述可降解的过敏原包括伴大豆球蛋白的a亚基和0-伴大豆球蛋白的a'亚基。
[0008] 所述方法，是使用三步法，即依次利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析柱和凝胶 过滤层析柱，从BacillusSp.BBE201108的发酵液中获得了电泳纯的蛋白酶。
[0009] 所述方法，具体包括：（1)硫酸铵分级沉淀：在发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉 末至饱和度为35-80 %，离心去上清；然后再缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度为50-85 %，离 心取沉淀，将沉淀的蛋白复溶；（2)透析：将上述复溶后的蛋白进行透析；（3)阴离子交换 层析：将透析后的蛋白进行阴离子交换层析，初始上样缓冲液为l〇-l〇〇mM的缓冲液，pH 8. 0-10. 0,洗脱液为上样缓冲液中加入0. 1-1.Omol/LNaCl，洗脱；（4)凝胶过滤层析：利用 凝胶过滤层析柱进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。
[0010] 所述硫酸铵分级沉淀，在本发明的一种实施方式中，是在0-10°C下完成的。
[0011] 所述硫酸铵分级沉淀，在本发明的一种实施方式中，是先添加硫酸铵粉末至饱和 度为50 %，离心取上清后再添加到饱和度为80 %。
[0012] 所述透析，在本发明的一种实施方式中，透析缓冲液为阴离子交换层析柱（QFF) 的上样缓冲液。
[0013] 所述透析，在本发明的一种实施方式中，是在0-10°C下完成的。
[0014] 所述阴离子交换层析，在本发明的一种实施方式中，为QFF，购自GEHealth公司。
[0015] 所述阴离子交换层析中的缓冲液为以下任意一种：Tris_HCl、磷酸钠缓冲液、 Gly-NaOH缓冲液。
[0016] 所述阴离子交换层析，在本发明的一种实施方式中，初始上样缓冲液为25mM的 Tris-HCl,pH9. 0〇
[0017] 所述洗脱，在本发明的一种实施方式中，是线性洗脱或者梯度洗脱。
[0018] 所述凝胶过滤层析柱，在本发明的一种实施方式中，为Superdex7510/300GL或 HiLoad16/60Superdex200prepgrade。
[0019] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括：
[0020] 1)硫酸铵分级沉淀：于4°C下向发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末，至饱和度为 50%，于4°C，7000rpm离心取上清液；向上述获得的上清液中于4°C下缓慢添加硫酸铵粉 末，至饱和度为80%，于4°C，7000rpm离心取沉淀，将沉淀后的蛋白复溶；
[0021] 2)透析：将上述复溶后的蛋白于4°C下进行透析，透析缓冲液为阴离子交换层析 柱（QFF)的上样缓冲液，即 25mmol/L的Tris-HCl，pH9. 0 ;
[0022] 3)阴离子交换层析方法，初始上样缓冲液为25mM的Tris-HCl，pH9. 0,洗脱液为 上样缓冲液中加入lmol/LNaCl，线性洗脱；
[0023] 4)利用凝胶过滤层析柱（Superdex75)进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋 白。
[0024] 本发明还提供一种利用所述蛋白酶降解大豆蛋白过敏原的方法，是将纯化后的蛋 白酶与0.1-8%的大豆分离蛋白（soyproteinisolates，SPI)按照每lmLSPI溶液添加 30-500U蛋白酶，于 20-60°C反应 5-30min。
[0025] 所述降解大豆蛋白过敏原的方法，在本发明的一种实施方式中，是按照每lmL的 1%SPI溶液中添加250U的