一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞免疫技术领域，特别一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细 胞。
【背景技术】
[0002] 细胞免疫治疗疗法是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增 多、靶向杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的 细胞，打破免疫耐受、激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。细胞免疫 治疗具有副作用小、靶向治疗、作用范围更加广泛等特点，在临床研宄中备受关注。据报道， 经过多个疗程的细胞免疫治疗，能够有效杀除患者体内肿瘤细胞，促进康复，改善患者的生 活质量。树突状细胞疗法是目前研宄最多的细胞免疫治疗疗法之一。
[0003] 树突状细胞（Dendriticcells，DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞（Antigen presentingcell，APC)，一方面，其能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答；另一方面， 树突状细胞还能够呈递抗原给MHC-I类限制性⑶8+和MHC-II类限制性⑶4 +T淋巴细胞，诱 导特异性免疫反应，被称为"天然免疫佐剂"，因此，树突状细胞在诱导免疫应答中具有独特 的地位。近年来，以DC细胞为基础的免疫治疗在临床应用中得到越来越广泛的关注，是国 内外研宄的热点。
[0004] 随着研宄的深入，发现充足的DC细胞成为了DC细胞免疫治疗研宄中的技术瓶颈。 现有的DC细胞制备方法中，大多采用抽取外周血培养，分离出造血干细胞，之后在多种细 胞因子存在下培养、诱导所得造血干细胞，制备获得DC细胞。整个过程操作复杂，并且因为 细胞来源数量低、所得造血干细胞的数量也少，最终影响了DC细胞数量和质量，导致治疗 效果不理想。所以，十分有必要需找新的DC细胞的制备方法。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的发明目的在于提供了一种树突状细胞的制备方法、所得树突 状细胞。本发明利用间充质干细胞，成功制备获得了树突状细胞，为树突状细胞的制备提供 了一种新的制备方法，且操作简单，可用于树突状细胞的大量制备。
[0006] 为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种树突状细胞的制备方法，其包括以下步骤：
[0008] 步骤1 :获得间充质干细胞；
[0009] 步骤2 :取所得间充质干细胞，贴壁培养后，得贴壁细胞；
[0010] 步骤3 :培养、诱导所得贴壁细胞，收集树突状细胞。
[0011] 间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC)，是一类多能干细胞，源于发育早 期的中胚层和外胚层。主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由 于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。间充质干细胞属于非终末分化细胞， 它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件 下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛0细胞和内皮等多种组织细 胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质 干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性，使其 在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。通过自体移植可以 重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。优选地，本发明提供的制备方法中 的间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。在本发明 的一些实施例中，本发明提供的制备方法中的间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本发明 以间充质干细胞为种子细胞，贴壁培养后，诱导所得贴壁细胞，即制备获得树突状细胞，操 作简单，可用于树突状细胞的大量制备。
[0012] 优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中的诱导所用诱导试剂包括第一诱导 试剂和第二诱导试剂；
[0013] 该第一诱导试剂包括GM-CSF、IL-4、胎牛血清和谷氨酰胺；
[0014]该第二诱导试剂包括TNF-a。
[0015]GM-CSF为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，是一种细胞因子。优选地，本发明提供 的制备方法中，第一诱导试剂中GM-CSF的浓度100ng/mL?200ng/mL。在本发明的一些实施 例中，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中的GM-CSF的浓度为100ng/mL。在本发明 的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中的GM-CSF为rhGM-CSF。
[0016]IL-4为白细胞介素4,是一种细胞因子。优选地，本发明提供的制备方法中，第一 诱导试剂中IL-4的浓度为30ng/mL?50ng/mL。在本发明的一些实施例中，本发明提供的 制备方法中，第一诱导试剂中的IL-4的浓度为30ng/mL。在本发明的另外一些实施例中，本 发明提供的制备方法中，IL-4为rhIL-4。
[0017] 优选地，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中胎牛血清的浓度为10%。
[0018] 优选地，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中，谷氨酰胺的浓度为2mmol/L?4mmol/L。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，第一诱导试剂中，谷氨 酰胺的浓度为2mmol/L。
[0019] TNF-a是一种肿瘤坏死因子。优选地，本发明提供的制备方法中，第二诱导试剂 中，TNF-a的浓度为500UI/mL?150〇n/mL。在本发明的一些实施例中，本发明提供的制 备方法中，第二诱导试剂中，TNF-a的浓度为l〇〇〇n/mL。
[0020] 优选地，本发明提供的制备方法中，步骤3中培养、诱导包括：
[0021] 向所得贴壁细胞中加入含第一诱导试剂的培养液，培养；在补加含第一诱导试剂 的培养液之后，再加入含第二诱导试剂的培养液；之后，进行检测，收集树突状细胞，即得。
[0022] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤3中所述培养、诱导具 体为：
[0023] 向所得贴壁细胞中加入含第一诱导试剂的培养液，培养；
[0024]在培养的第三天补加半量该含第一诱导试剂的培养液；
[0025]在培养的第六天，半量离心，补加含第二诱导剂的培养液，
[0026] 在培养的第七天，进行检测，收集树突状细胞，即得。
[0027]在本发明的一些实施例中，所述收集树突状细胞为：将诱导并促熟后的DC细胞离 心清洗后吸去上清，加入lmL细胞冻存液，混匀后冻存于2mL的冻存管中，置于冻存盒中，放 入-80 °C冰箱，次日转入液氮保存；所述细胞冻存液包括20%人血白蛋白、无血清培养基和DMSO,所述20%人血白蛋白、无血清培养基和DMSO的体积比为5:4:1。
[0028] 在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法中，步骤1中获得间充质干细 胞的方法具体为：
[0029] 获得沃尔顿胶，种植于含FBS的1640培养液中，组织块贴壁法培养，即获得间充质 干细胞。
[0030] 间充质干细胞的制备方法优选但不限定为本发明提供的制备方法，本领域技术人 员可以根据实际情况选择制备间充质干细胞的方法。
[0031] 本发明提供了一种树突状细胞的制备方法、所得树突状细胞。本发明提供的树突 状细胞的制备方法包括：获得间充质干细胞；取所得间充质干细胞，贴壁培养后，得贴壁细 胞；培养、诱导所得贴壁细胞，收集树突状细胞。本发明提供的制备方法利用间充质干细胞 作为种子细胞，贴壁培养后，诱导所得贴壁细胞，即制备获得树突状细胞，操作简单，可用于 树突状细胞的大量制备，使该制备方法更利于推广和应用。实验结果证实，本发明提供的制 备方法成功制备获得了树突状细胞，所得树突状细胞与常规方法所得树突状细胞相比，形 态及功能上并无差异，说明该方法可用于树突状细胞的大量制备。
【附图说明】
[0032] 图1示实施例2所得间充质干细胞细胞分析结果；其中，图1-A为间充质干细胞的 流式图；图1-B为间充质干细胞的倒置显微镜下形态图；
[0033] 图2示实施例2中所得树突状细胞的流式细胞分析结果；其中，DC代表树突状细 胞；
[0034] 图3示实施例2中所得树突状细胞的HLA-DR+CD86+的流式细胞分析结果；
[0035] 图4示实施例2中所得树突状细胞的⑶83+CD86+的流式细胞分析结果；
[0036] 图5示实施例2中所得