的基因重组菌株及选育方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种生产纽莫康定Btl的基因重组菌株及 选育方法和应用。
【背景技术】
[0002] 棘白菌素类抗真菌药物为一种新型的脂肽类化合物，通过非竞争抑制真菌细胞壁 中特有的β-1-3-葡聚糖合酶活性进而抑制真菌细胞壁的合成，且对人体不造成影响。这 种明显不同于两性霉素这类传统抗生素药物的作用机制，使得棘白菌素类具有广谱性强、 耐药性小、药物间相互作用小的特点，成为了未来低毒、安全、广谱性的新型抗生素的发展 方向。
[0003] 卡泊芬净是第一个被批准上市的棘白菌素类抗真菌药，由丝状真菌Glarea Iozoyensis的次级代谢产物纽莫康定B ci经化学修饰衍生而得，默克公司开发其作为一种广 谱的抗真菌/抗肺囊虫药物。卡泊芬净于2001年2月在美国上市，主要用于治疗患有侵染 性的曲霉病而又不适合用两性霉素 B或伊曲康唑治疗的患者。除此之外，在无免疫应答患 者中，此药可用于曲霉病、假丝酵母病的初期治疗用药；还可用于对抗生素产生抗性的嗜中 性白细胞减少症患者以及某些儿科适应症。
[0004] Glarea Iozoyensis发酵生产纽莫康定Btl的过程中，会产生多种结构类似物，包括 纽莫康定Atl、纽莫康定C tl、纽莫康定B1、纽莫康定B2和纽莫康定D ^等。其中主要的结构类似 物Atl和Ctl对后期的分离提取造成了极大的困难。默克公司对原始菌株ATCC20868进行了诱 变选育，获得了纽莫康定B tl高产菌株ATCC20957,但是该菌株的纽莫康定B ^产量仅285mg/ L，且纽莫康定Atl含量较高，两者浓度之比（BcZAtl)为10。随后对ATCC20957进行NTG诱变， 获得了纽莫康定B tl高产菌株ATCC74030,纽莫康定B ^的产量得到的了提升，纽莫康定A ^的 含量进一步降低，纽莫康定Bc/纽莫康定Atl为80,纽莫康定C /5%。目前纽莫康定Btl发酵 的最高产量为5. 2g/L。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种能稳定高产纽莫康定Btl且副产物少的基因重组菌。
[0006] 本发明的另一目的是提供选育该基因重组菌的方法。
[0007] 本发明的另一目的是利用该基因重组菌发酵生产纽莫康定Btl的方法。
[0008] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0009] -、一种生产纽莫康定Btl的基因重组菌株，其分类命名为Glarea Iozoyensis Q45,该菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏登记号为CCTCC NO :M 2014416,保藏时 期为2014年9月14。
[0010] 二、本发明所述的生产纽莫康定Btl的基因重组菌株Glarea lozoyensis Q45的选 育方法，包括下列步骤：
[0011] ⑴原生质体的制备
[0012] 将Glarea Iozoyensis原始菌株接入种子培养基培养，收集菌丝，用酶解液酶解， 制成原生质体；
[0013] 2)原始突变子库
[0014] 将步骤1)制备的原生质体体积均分为两组，分别采用常压室温等离子体（ARTP) 和氯化锂进行诱变处理，将获得的突变株涂布于再生培养基上，挑取生长良好的菌落进行 发酵测定纽莫康定B tl，挑选产量高的突变株进行斜面传代考察稳定性，获得多株性质稳定 的高产突变株，形成突变子库；
[0015] 3)原生质体的融合
[0016] 将步骤2)得到的性状稳定的突变菌株，按照步骤1)制备原生质体，每株突变株的 原生质体都等体积均分为两组，一组采用ARTP注入灭活，另一组采用热灭活，将两组灭活 后的原生质体混合加入融合液进行随机融合；
[0017] 4)融合子的筛选
[0018] 通过步骤3)获得的融合后的原生质体用高渗缓冲离心洗涤后，涂布于再生培养 基上，挑取生长良好的菌落进行发酵测定纽莫康定B tl，得到纽莫康定Btl高产基因重组菌株；
[0019] 5)以步骤4)所得的纽莫康定Btl高产基因重组菌株为出发菌株，多次重复进行步 骤3)-5)的原生质体制备、融合、筛选工作；
[0020] 6)遗传稳定性考察
[0021] 对步骤5)获得纽莫康定Btl高产基因重组菌株进行遗传稳定性实验检测，获得一 株产纽莫康定B tl高且稳定的突变株，S卩本发明所述的基因重组菌株Glarea Iozoyensis Q45〇
[0022] 三、利用本发明所述的Glarea lozoyensis Q45的菌株发酵生产纽莫康定Btl的方 法：是将Glarea lozoyensis Q45的菌丝接种于种子培养基培养后，再接种于发酵培养基中 进行发酵生产纽莫康定Btl。
[0023] 具体步骤包括：
[0024] 1)将斜面培养好的Glarea lozoyensis Q45菌株的菌丝接入到种子培养基中，在 24-28°C，180-300rpm条件下培养2-3天，得种子液；
[0025] 2)将种子液按发酵培养基体积5-15 %的接种量接种于发酵培养基中，在 24-28°C，200-500rmp 条件下培养 9-11 天。
[0026] 为了提高纽莫康定Btl的产量，在步骤2)的发酵过程中的第3-11天，以 0· 05-0. 4g< · Γ1 · IT1的速度流加浓度为10-20% (v/v)的甘露醇。
[0027] 所述培养基为：种子培养基配方为（g/L):碳源10-70,氮源10-80, KH2PO4O-I, FeSO4 · 7H200. 005-0. 015, MnSO4 · 4H20 0. 005-0. 015, ZnSO4 · 7H20 0. 001-0. 003, CaCl2 · 2H20 0· 005-0. 015, CuCl2 · 2H20 0· 00(Π -0· 0005, H3BO3O. 0002-0. 0006，（NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.0002-0. 0006 ；
[0028] 发酵培养基配方为（g/L):碳源40-150,氮源1-50,氨基酸0. 1-20, KH2P040-3， FeSO4 · 7H200. 005-0. 015, MnSO4 · 4H20 0. 005-0. 015, ZnSO4 · 7H20 0. 001-0. 003, CaCl2 · 2H20 0· 005-0. 015, CuCl2 · 2H20 0· 00(Π -0· 0005, H3BO3O. 0002-0. 0006，（NH4)6Mo7O24 · 4H20 0.0002-0. 0006 ；
[0029] 所述碳源包括葡萄糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉、甘油、麦芽糖、蔗糖、肉豆蔻酸中 的一种或多种；所述氮源包括黄豆粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米蛋白粉、蛋白胨、大豆蛋白 胨、酵母粉、酵母浸出粉、玉米浆、硫酸铵、氯化铵、尿素中的一种或多种任一比例的混合物； 所述氨基酸包括谷氨酸、谷氨酸钠、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、苏氨酸、异亮氨酸中的 一种或多种任一比例的混合物。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] Glarea lozoyensis Q45发酵11天后纽莫康定Btl产量可以达到6g/L，而副产物 纽莫康定Q1的含量小于3%，纽莫康定A ^的含量未检测到，因而此基因重组菌除能够高产 纽莫康定Btl外，还具有副产物少、发酵周期短的优点；另外由于利用此工艺生产的纽莫康定 Btl有利于后续的分离提取和工艺放大，因此具有巨大的工业价值。
【具体实施方式】
[0032] 一般性说明
[0033] PDA 培养基（g/L) :土豆 200,蔗糖 20。
[0034] 再生培养基（g/L) :NaCl 46. 7, 土豆 200,蔗糖 20,琼脂 2. 2。
[0035] 氯化锂再生培养基（g/L) :LiCl 3. 5, NaCl 46. 7, 土豆 200,蔗糖 20,琼脂 2. 2。
[0036] 高渗缓冲液I的配制方法为：取2. 7218g KH2PO4,4. 64g NaCl加入80ml哇哈哈水 溶解，用NaOH调PH到6. 0,用水定容到IOOml ;
[0037] 高渗缓冲液II的配制方法为：0. 6mol/L的葡萄糖溶液；
[0038] 酶解液的制备方法为：取Yatalse 80g，融壁酶80g，蜗牛酶80g，用IL高渗缓冲液 I溶解。
[0039] 发酵液的预处理：
[0040] 取Iml发酵液，加入9ml乙醇，剧烈振荡lOmin，然后离心3000rpm，lOmin，离心后 的上清用于进一步检测。
[0041] 纽莫康定Atl、纽莫康定Btl的检测：
[0042] 采用戴安高效液相色谱U3000测定，其具体方法为：色谱柱，C18柱；流动相A， 乙腈；流动相 Β，0· 1% 的磷酸；洗脱程序，0min_20min，A:B = 40:60,20min_40min，A:B = 50:50 ;流速1.5ml/min，检测波长，210nm;检测温度，25°C。
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