一种用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学工程材料领域，具体涉及一种用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]近年来，基于水溶性阳离子聚合物的非病毒基因传递载体发展迅速，已成为生物医用高分子的前沿研宄领域和热点。目前，阳离子聚合物基因载体的最重要发展趋势是:通过聚合物化学结构改变和性能调控，同时负载质粒DNA和多为疏水性的抗肿瘤药物分子，以进行基因和药物共传递并实现协同增效治疗(Wang et al.NatureMaterials, 2006, 5:791 - 796 ；Hyun, et al.B1materials, 2011, 32:306 - 315)。然而迄今用于基因和药物共传递的载体，几乎全局限于由两亲性合成类共聚物经自组装形成的阳离子化胶束，不仅得率低、不易生物降解，且其制备组装过程相对复杂、难以控制。
[0003]直链淀粉是主客体化学研宄中源自天然多糖的一种重要主体分子，具有来源广、可再生、生物相容性好和可生物降解等优点。借助其内疏水、外亲水的螺旋链空腔结构，直链淀粉可选择性地包合一些无机物(如碘、氢氧化钾)、有机物(如表面活性剂、脂质)和聚合物(如聚醚、聚酯)，显示出类似于环糊精的分子组装特性与应用前景(李本刚，张黎明.化学进展，2010，22:1161 - 1168)。但到目前为止，尚未见有研宄涉及直链淀粉或其改性物对疏水性抗肿瘤药物分子的包合及其与基因的联合传递。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物的制备方法。
[0005]本发明的另一个目的在于提供上述制备方法得到的用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物。该改性物生物相容性好，可生物降解，既含有可与疏水性抗肿瘤药物分子发生包合作用的螺旋链空腔，又含有可与质粒DNA发生静电复合作用的阳离子链段，在基因和药物共传递研宄方面显示出良好的应用前景。
[0006]本发明的再一个目的在于提供上述直链淀粉改性物在制备基因和抗肿瘤药物共传递物质中的应用。该应用方法首先通过超声与磁力搅拌方法，利用其螺旋链空腔对疏水性抗肿瘤药物进行物理包埋；然后再利用其树状聚赖氨酸侧链上的大量氨基与质粒DNA发生静电复合，得到一种共传递基因和疏水性抗肿瘤药物的物质。
[0007]本发明的目的通过下述技术予以实现:
[0008]上述直链淀粉改性物基因载体的制备方法，包括以下步骤:
[0009]一种用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物的制备方法，具体包括以下步骤:
[0010](I)将干燥直链淀粉与1-叠氮-环氧丙烷混合溶于氢氧化钠水溶液中，在30?40°C条件下避光搅拌24?36h ;反应结束后，将反应产物透析，过滤，冷冻干燥得到含叠氮基团的直链淀粉；
[0011](2)将3代含炔基树枝状聚赖氨酸与步骤(I)所得含叠氮基团的直链淀粉混合溶于无水二甲基亚砜；室温条件下通入N2保护15?30分钟，然后加入五水硫酸铜和抗坏血酸钠，升温至40?50°C反应24?48小时；反应结束后将产物透析，冷冻干燥，得到用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物。
[0012]步骤(I)所述干燥直链淀粉是将直链淀粉置于真空干燥箱中，在50?80°C条件下干燥12?48小时得到；所述1-叠氮-环氧丙胺和直链淀粉中糖环的摩尔比为1: (I?2);所述氢氧化钠水溶液的浓度为每100毫升水中加入0.4?0.8克氢氧化钠计；所述氢氧化钠水溶液的使用量以每100毫升氢氧化钠水溶液溶解0.5?I克干燥直链淀粉；所述透析条件为14000截流量透析袋透析48?72小时。
[0013]步骤⑵所述3代含炔基树枝状聚赖氨酸是按专利号为ZL201210005079.8的中国发明专利中所述的方法制备得到的。所使用的1-叠氮-环氧丙烷是按照文献N.Pahimanolis, et al.Carbohydrate Polymers, 2010, 82, 78 - 82.；F.Fringuelli, etal.Journal of Organic Chemistry, 1999, 64, 6094 - 6096.制备而成。
[0014]步骤(2)所述含叠氮基团的直链淀粉中的糖环、3代含炔基树枝状聚赖氨酸、五水硫酸铜、抗坏血酸钠的摩尔比为1: (8?10): (I?1.2): (2?2.5);所述无水二甲基亚砜的制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到二甲基亚砜中搅拌6?24小时，减压蒸馏，得到无水二甲基亚砜，所述氢化钙的加入量以每500毫升二甲基亚砜中加入I?2克计；所述无水二甲基亚砜的使用量以平均每0.5?I克含叠氮基团的直链淀粉使用100毫升无水二甲基亚砜计；所述透析条件为14000截流量透析袋透析48?72小时；所述室温为5?
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[0015]步骤(2)所得用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物的产率为50?80%，由元素分析确定树状聚赖氨酸侧链含量为8?11%。
[0016]一种根据上述制备方法得到的用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物。
[0017]上述用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物在制备基因和抗肿瘤药物共传递物质中的应用。所述的应用，照以下操作步骤:
[0018](I)将用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物溶解于去离子水中配置成5?10晕克/晕升的水溶液，加入姜黄素，超声30?60分钟并在室温下搅拌12?24小时；将样品用透析袋透析，然后过滤，冷冻干燥得到直链淀粉改性物/姜黄素包合物；
[0019](2)将直链淀粉改性物/姜黄素包合物溶解于PBS缓冲液中，加入质粒DNA，混合均匀后于37?40°C条件下静置15?30分钟，使直链淀粉改性物/姜黄素包合物与pDNA形成稳定的复合物。
[0020]步骤(I)所述室温为5?35°C ;所述用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物与姜黄素的质量比为1: (I?1.5);所述透析条件为14000截流量透析袋透析6?12小时。
[0021]步骤⑵所述PBS缓冲液pH值为7.2?7.4 ;所述PBS缓冲液的使用量以每10毫升PBS缓冲液加入5?10克直链淀粉改性物/姜黄素包合物计；所述质粒DNA在复合物中的浓度为0.2?0.8微克/微升。
[0022]上述用于基因和抗肿瘤药物共传递的直链淀粉改性物可作为基因和抗肿瘤药物共传递物质中的应用在生物医学领域中。
[0023]本发明具有如下优点和有益效果:
[0024](I)选用可生物降解的直链淀粉作为主要原材料，不仅有利于降低产物细胞毒性，而且其螺旋链空腔还可赋予材料包合疏水性抗肿瘤药物的能力；
[0025](2)采用点击化学反应来制备直链淀粉改性物，不仅反应条件温和、易于操作，而且尚效、具有选择性；
[0026](3)利用3代含炔基树枝状聚赖氨酸作为侧链连接到直链淀粉上，一方面改善了直链淀粉的水溶性，另一方面其含有的大量阳离子氨基还赋予直链淀粉与质粒DNA的结合能力，使直链淀粉改性物在基因和药物共传递领域有潜在应用价值。
【附图说明】
[0027]图1为Amy-g-PLLD/Curcumin包合物体外药物释放曲线图。
[0028]图2为不同N/P比的Amy-g-PLLD/Curcumin/pDNA复合物的凝胶电泳照片图。
[0029]图3为Amy-g-PLLD/Curcumin/pDNA复合物平均粒径与N/P比的关系图。
[0030]图4为Amy-g-PLLD/Curcumin/pDNA复合物表面电势与N/P比的关系图。
[0031]图5 为 N/P = 20 (A)和 N/P = 30 (B) Amy-g-PLLD/Curcumin/pDNA 复合物的透射电镜照片图。
[0032]图6 为 Amy-g-PLLD/Curcumin/pDNA 复合物细胞转染图(A、N/P = 10, B,N/P = 20，C、N/P = 30)。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体的实例与附图对本发明作进一步详细的叙述，但本发明的实施方法灵活，不仅仅限于此例所述的具体操作方式。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0034]以下实施例所使用的无水二甲基亚砜的制备方法按照以下操作步骤:将氢化钙加入到二甲基亚砜中搅拌6?24小时，减压蒸馏，得到无水二甲基亚砜，所述氢化钙的加入量以每500毫升二甲基亚砜中加入I?2克计；
[0035]以下实施例所使用的干燥直链淀粉的制备方法按照以下操作步骤:将直链淀粉置于真空干燥箱中，50?80 °C条件下干燥12?48小时；所使用的3代含炔基树枝状聚赖氨酸是按专利号为ZL201210005079.8的中国发明专利中所述的方法制备得到的；所使用的1-叠氮-环氧丙烧是按照文献N.Pahimanolis, et al.CarbohydratePolymers,2010,82,78 - 82.；F.FringuelIi,et al.Journal of OrganicChemistry, 1999, 64, 6094 - 6096.制备而成。
[0036]实施例1
[0037]将0.48g干燥直链淀粉与SmL 1-叠氮-环氧丙烷混合溶于20mL氢氧化钠水溶液(每100毫升水中加入0.4克氢氧化钠形成的氢氧化钠水溶液)中，在30°C条件下避光搅拌24h ;反应结束后，将反应产物140