本发明涉及生物技术领域中，单核苷酸多态性位点rs2523607在筛查疱疹样皮炎患者中的应用。
背景技术：
疱疹样皮炎(dermatitisherpetiformis，dh)是一种由谷胶摄入所引起的一种少见的自身免疫性大疱性皮肤病，其主要特征是瘙痒性多形皮损和真皮乳头iga的沉积。近来，dh被认为是乳糜泄的特异性皮肤表现，原因是dh患者体内存在着循环iga抗体、表皮转谷氨酰胺酶抗体及与小肠绒毛萎缩类似的典型的组织学特征。在不同的人群中，dh的发病率和流行率不同。其中，在白种人中dh较为常见，而在亚洲人群中较罕见。对于中国血统的人群，只有在中国大陆，香港和新加坡报道了一些散发病例。
dh的遗传性还没有得到很好的认知，但是在多个人群中已报道的hlai类和ii类分子的研究表明了dh的遗传易感性。dh患者早期阶段的病例对照研究表明dh和hla-b8,dr3,和dqw2密切相关。在白种人群的克隆恩病中，超过90％的患者有hla-dq2单倍体型，其余大部分表达hla-dq8，nod
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何筛查疱疹样皮炎患者与检测疱疹样皮炎易感性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述a1)-b6)中的至少一种用途：
a1)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备筛查疱疹样皮炎患者产品中的应用；
a2)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测疱疹样皮炎易感性产品中的应用；
a3)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
a4)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；
a5)人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型在制备筛查疱疹样皮炎患者产品中的应用；
a6)人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型在制备检测疱疹样皮炎易感性产品中的应用；
b1)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在筛查疱疹样皮炎患者中的应用；
b2)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在检测疱疹样皮炎易感性中的应用；
b3)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在检测与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性的中的应用；
b4)检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性的中的应用；
b5)人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型在筛查疱疹样皮炎患者中的应用；
b6)人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型在检测疱疹样皮炎易感性中的应用的多态性(即等位基因)或基因型的物质在制备检测疱疹样皮炎易感性产品中的应用。
rs2523607是人染色体6p21.33上的一个二等位多态性的snp位点，该变异是颠换(a/t，在其互补链上则为t/a)。所述rs2523607基因型是aa、at或tt。所述aa是rs2523607位点为a的纯合型，所述tt是rs2523607位点为t的纯合型，所述at是rs2523607位点为a和t的杂合型。所述检测人基因组中rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型具体可为检测rs2523607的核苷酸种类。
上述用途中，所述检测人基因组中rs2523607的多态性或基因型的物质可为扩增包括rs2523607在内的基因组dna片段的pcr引物对和/或单碱基延伸引物。
上述用途中，所述aa和所述at基因型的个体在疱疹样皮炎患者群体中的比例分别高于对应的基因型在正常人群体中的比例。
上述用途中，所述疱疹样皮炎具体可为中国人群疱疹样皮炎。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有检测人基因组中rs2523607的多态性或基因型的物质的产品，所述产品为a)-d)中的任一种产品：
a)检测与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的产品；
b)鉴定或辅助鉴定与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的产品；
c)筛查疱疹样皮炎患者产品；
d)检测疱疹样皮炎易感性产品。
上述产品中，所述检测人基因组中rs2523607的多态性或基因型的物质可为扩增包括rs2523607在内的基因组dna片段的pcr引物对和/或单碱基延伸引物。
上述产品中，所述疱疹样皮炎具体可为中国人群疱疹样皮炎。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述m1)或m2)的方法：
m1)筛查疱疹样皮炎患者的方法，包括：检测待测对象基因组中rs2523607位点的基因型，如rs2523607位点的基因型为aa基因型，所述待测对象为或候选为疱疹样皮炎患者；如rs2523607位点的基因型为at基因型，所述待测对象为或候选为疱疹样皮炎患者；如rs2523607位点的基因型为tt基因型，所述待测对象为或候选为或非疱疹样皮炎患者；
m2)检测疱疹样皮炎易感性的方法，包括：检测待测对象基因组中rs2523607位点的基因型，如rs2523607位点的基因型为aa基因型，所述待测对象易感或候选易感疱疹样皮炎；如rs2523607位点的基因型为at基因型，所述待测对象易感或候选易感疱疹样皮炎；如rs2523607位点的基因型为tt基因型，所述待测对象不易感或候选不易感疱疹样皮炎。
上述方法中，检测待测对象基因组中rs2523607位点的基因型可采用所述检测rs2523607的多态性或基因型的物质进行。
上述方法中，所述疱疹样皮炎具体可为中国人群疱疹样皮炎。
实验证明，rs2523607的风险等位基因为a，该等位基因在疱疹样皮炎患者群体中的比例显著高于该等位基因在正常健康人群中的比例。rs2523607的p值是6.87×10-15，且rs2523607的相对危险度是28.7，说明rs2523607是与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性。rs2523607的三个基因型中，at基因型的个体在疱疹样皮炎患者群体中的比例(13/36)高于该基因型的个体在正常人群体中的比例(11/720)，tt基因型的个体在疱疹样皮炎患者群体中的比例(23/36)低于该基因型的个体在正常人群体中的比例(709/720)。
本发明在实际应用中，可将检测rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查疱疹样皮炎患者的产品。
其中，检测人基因组中rs2523607的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs2523607的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、snp芯片、taqman探针技术和sequenommassarray技术。其中，利用sequenommassarray技术确定rs2523607的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括pcr引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶、树脂、芯片、maldi-tof(matrix-assistedlaserdesorption/ionization–timeoffligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)和/或sequenommassarray技术所需要的其他试剂和仪器；利用taqman探针技术确定rs2523607的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括taqman探针、pcr引物对、定量pcr仪、进行基因分型的模块和/或taqman探针技术所需要的其他试剂；snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片和/或基于荧光分子dna结合反应的芯片。在本发明的一个实施例中，利用的是illumina公司的infiniumhumanexomebeadchip芯片。
所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒和仪器组成的系统，如由引物和dna测序仪组成的系统，由pcr试剂和dna测序试剂和dna测序仪组成的系统，由taqman探针、pcr引物对、定量pcr仪和进行基因分型的模块以及taqman探针技术所需要的其他试剂组成的系统，由探针、pcr引物对以及连接酶检测反应(ldr)所需要的其他试剂和仪器组成的系统，由pcr引物对、单碱基延伸引物、芯片、pcr仪、进行基因分型的模块和/或sequenommassarray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。
采用pcr引物扩增包括rs2523607在内的基因组dna片段，以得到的pcr扩增产物为模板，采用单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，对得到的延伸产物的序列进行检测，确定rs2523607的多态性(即等位基因)和基因型。所述pcr引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括rs2523607在内的基因组dna片段即可，具体可为序列表中序列1和序列2所示的单链dna。所述延伸引物根据人基因组中rs2523607上游(不包括该snp位点)设计，所述延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中rs2523607的前1位核苷酸。
本发明中，所述pcr引物对可由rs2523607_w1_f和rs2523607_w1_r组成；
所述rs2523607_w1_f是如下a1)至a4)中的任一种单链dna：
a1)序列表中序列1所示的单链dna；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链dna；
a3)与a1)或a2)限定的单链dna具有85％以上的同一性的单链dna；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链dna杂交的单链dna；
所述rs2523607_w1_r是如下b1)至b4)中的任一种单链dna：
b1)序列表中序列2所示的单链dna；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链dna；
b3)与b1)或b2)限定的单链dna具有85％以上的同一性的单链dna；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链dna杂交的单链dna。
所述单碱基延伸引物(rs2523607_w1_e)可为如下c1)至c4)中的任一种单链dna：
c1)序列表中序列3所示的单链dna；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链dna；
c3)与c1)或c2)限定的单链dna具有85％以上的同一性的单链dna；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链dna杂交的单链dna。
所述添加一个或几个核苷酸得到的单链dna可为添加一至十个核苷酸得到的单链dna。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1、序列2或序列3所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
在本发明的实施例中，rs2523607应用sequenom基因分型平台即
本发明在一个来自中国人群的样本(36例疱疹样皮炎患者和720例健康者)中发现rs2523607是与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性。可将检测rs2523607的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型的物质)联合在一起制备筛查疱疹样皮炎患者的产品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、rs2523607是与疱疹样皮炎相关的单核苷酸多态性
研究对象
全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy，gwas)发现阶段的研究对象包括24例疱疹样皮炎患者(dh患者)和480例正常对照，验证阶段包括12例疱疹样皮炎患者(dh患者)和244例正常对照。所有研究对象均来自于中国人群。
病例组所有疱疹样皮炎患者符合以下3条：1)临床特点：红斑基础上的簇集性小水疱；2)免疫学检查包括皮肤活检组织的直接免疫荧光与血浆样本的间接免疫荧光证实其为疱疹样皮炎患者；3)elisa分析证实其为疱疹样皮炎患者。
对照组所有正常对照都被临床证实无自身免疫性疾病。
所有患者和对照的特点见表1。年龄分布、性别比例在病例组和对照组中均无显著差异。
表1、研究设计的样本临床资料
注：表1中na表示无相应的病程、检测或症状。
本研究经山东省皮肤病性病防治研究所伦理审查委员会批准。所有研究对象都已签署知情同意书。
所用样本为每位患者的大约2ml全血，提取基因组dna用于基因型分析。
发现阶段(第一阶段)
对发现阶段的24例dh患者、480例正常对照应用涵盖900015个snps的illuminaomnizhonghua芯片进行基因分型。在进一步分析时排除了总体基因分型率<96％或杂合体率超过平均值±3s.d.的样本(4例对象)；通过继承等同分析(ibd)(pi_hat>0.25)确定可能的重复样本或亲戚样本也被排除。满足下列条件的snps也被排除：(i)没有映射到常染色体；(ii)callrate<90％；(iii)maf<0.01；(iv)对照中snp的基因型分布与hardy-weinberg平衡的预测值(p<10-5)相偏离。在对样本和snp进行质量过滤后，得到了包含24例dh患者及476例对照中的43826个常见独立的snps(r2<0.1)的数据集，将这些数据以及来自yri(来自尼日利亚，伊巴丹的约鲁巴人；n＝90)，ceu(来自北欧和西欧的犹太人；n＝90)，chb(n＝45)和jpt(n＝44)的hapmap样本一起进行pca分析，排除了0个异常的样本。发明人对剩余的病例和对照样本进行了另一轮pca，结果显示病例和对照都匹配很好。经过质量控制阶段，一共有24例dh及476例对照的806342个snps被纳入到全基因组snp推算。对于那些基于千人组计划的基准(2012年3月发布)而未分型的snps，发明人应用shapeit(delaneauetal.,2013)和impute_v2(howieetal.,2009)来定相和推算。低推算置信度(infoscore<0.8)，显著的hardy-weinberg连锁不平衡(p<10-5)或maf<5％的snps被排除于进一步的分析之外。最终，在gwas发现阶段一共有24例dh及476例对照对照中的5546030个snps被分型和推算。
snp验证阶段(第二阶段)
发明人选取了32个发现阶段关联分析中p<10-4的snps，在另一独立样本中选择12例dh患者和244例正常对照的独立样本中进行验证。在32个snps中，一共有21个snps被成功分型，callrate>90％且无显著hwe偏离(p>0.0003)。
其中，属于21个snps中的rs2523607为是人染色体6p21.33上的一个二等位多态性的snp位点，该变异是颠换(a/t，在其互补链上则为t/a)，rs2523607进行snp分型所用引物序列如下：
rs2523607_w1_f(正向引物)：acgttggatgagtaagtgctggcacacagg(序列1)
rs2523607_w1_r(反向引物)：acgttggatgtttcaagccccaggtagaag(序列2)
rs2523607_w1_e(延伸引物)：tgcctcattactggga(序列3)
rs2523607snp分型的具体操作步骤如下：
采用sequenommassarray(sandiego，usa)平台验证，每个样本约用到15ngdna。首先提取外周血的基因组dna，标准化后，样本dna经多重pcr反应扩增包括snp位点在内的基因组dna片段，扩增产物进行snp位点特异性单一链的延伸，延伸产物脱盐并转移到384孔的芯片上。质谱仪(maldi-tofms)进行等位基因的检测，采用sequenommassarray分型软件对检测结果进行分析。
1、全血标本采集
在患者知情同意，并签署书面同意书的情况下采集研究对象外周静脉血5ml，放置于edtana2抗凝管中，置-80℃冰柜储存备用。
2、dna浓度标准化包括如下步骤：
1)利用nanodrop-1000浓度测试仪准确测定每一份需要标准化的样本dna浓度和od比值(a260/a280、a260/a230)。
2)建立电子表格，排定每个样本孔需要加入的dna编号。
进行sequenommassarray分型的样本，在每96孔板上留有空白对照和重复样本对照。
3)按照电子表格的顺序，加入已测定浓度的dna。
对于进行sequenommassarray分型的样本要求实验浓度为12-30ng/μl，一般以18ng/μl为佳。并且a260/a280比值介于1.5-2.0之间、a260/230介于1.5-2.3，如dna浓度高于18ng/μl则加入适量fg3，将浓度标化至18ng/μl；如dna浓度低于12ng/μl，则重新从血液提取合格的dna。浓度在12—18ng/μl间直接加入。
离心后贴上粘性锡箔纸，并用标记笔标上样本板标号、样本类型、来源地等信息。
4)在平板离心机上，3000g离心3分钟，存放于-20℃备用。
3、利用正向引物和反向引物进行pcr。
4、利用延伸引物进行snp位点特异性单一链的延伸反应。
其中，延伸引物根据人基因组中snp位点上游(不包括该snp位点)设计，所述延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中该snp位点的前1位核苷酸。
5、数据质量控制
1)对分型的snp进行callrate计算，去除callrate<95％的snp或等位基因频率<0.01的snps；
2)对snp进行遗传平衡检验，去除偏离遗传平衡定律的snp(对照样本中hardy-weinberg平衡检验的p≦0.001)。
3)在sequenommassarray系统中查看snp的分型聚类图，去除聚类图分堆不清的snp。
4)样本质控：直接去除分型失败的样本。
将通过质控的样本和snp进行统计分析。
6、数据统计分析
利用plink1.07软件对分型成功并通过质控的snp在病例组和对照组做基因表型相关性分析，用cochran-armitagetrend检验每个样本的基因型和表型的关联性，然后用cochran-mantel-haenszel综合分析所有样本的基因型和表型的相关性。用q检验来评价个体间的异质性，本次实验中，以p<0.05作为检验水准。多重logistic回归分析用于检测区域内的信号的独立性。检验水准α以0.05除以通过质量控制的snp数目为检验水准。q检验用于评估遗传异质性的显著性，对snp校正检测后p值小于0.05者视为有显著遗传异质性。
在共计36例疱疹样皮炎(dh)患者和720例正常对照中，通过分析rs2523607与疱疹样皮炎的相关性，结果发现rs2523607是与疱疹样皮炎相关的风险位点，rs2523607的p值是6.87×10-15，or值为28.67。
表2、snp在dh患者和正常对照群体中的等位基因频率(％)
表2中，f_a为等位基因a在dh患者中的频率，f_u为等位基因t在dh患者中的频率。
由表2可知，rs2523607的三个基因型中，at基因型的个体在dh患者群体中的比例高于该基因型的个体在正常人群体中的比例，tt基因型的个体在dh患者群体中的比例低于该基因型的个体在正常人群体中的比例。
rs2523607的风险等位基因为a，该等位基因在发现阶段dh患者中的基因频率为16.7％，在正常对照中的基因频率为0.7％；a等位基因在第二阶段dh患者中的基因频率为20.8％，在正常对照中的基因频率为0.8％；合并分析发现a等位基因在dh患者中的基因频率为18.1％，在正常对照中的基因频率为0.8％，a等位基因在dh患者中的比例显著高于其在正常对照中的比例，显著性分析p值为6.87e-15,or为28.7。回顾性预测分析发现其预测敏感度为36.1％，特异度为98.5％。实验结果表明，rs2523607多态性或基因型或等位基因频率可用于dh患者的筛查。
<110>山东省皮肤病性病防治研究所
<120>单核苷酸多态性位点rs2523607在筛查疱疹样皮炎患者中的应用
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
acgttggatgagtaagtgctggcacacagg30
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
acgttggatgtttcaagccccaggtagaag30
<210>3
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
tgcctcattactggga16