本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种利用万寿菊花粕提取液为原料发酵生产虾青素的方法与应用。
背景技术：
虾青素是一种红色的酮式类胡萝卜素，是甲壳类动物鲑鱼和各种鸟类的主要色素，分子结构中含有非常长的共轭双键和α-羟基酮，由于此种特殊结构能够向自由基供应电子，从而使其极易和自由基反应，清除自由基，具有极强的生物抗氧化性，在食品、医药、化妆品及水产业等方面有着广阔的应用前景。目前，利用酵母发酵生产虾青素的常用底物是碳水化合物，最主要的是葡萄糖，另外还有木糖、果糖、蔗糖等，而使用葡萄糖又存在价格较高且与人争粮、与粮争地等问题，使虾青素的生产无法达到工业化的要求，因此寻找一种廉价的可再生的原料来发酵生产虾青素，降低生产成本，已成为目前亟待解决的问题。
万寿菊花粕，是万寿菊花经过提取叶黄素后而得到的副产品，成黄色、带纤维状，其性质与苜蓿草粉类似，广泛应用于畜、禽、鱼等饲料中，在各种饲料配比中可替代糠、麸类原料，是很好的绿色保健型饲料原料。随着叶黄素需求量的增加，万寿菊的种植面积不断扩大，从而使万寿菊花粕的产量逐年增加。2016年，仅广州立达尔生物科技股份有限公司生产叶黄素得到的万寿菊花粕就有2万吨。万寿菊花粕的主要成分：蛋白含量约12%，粗纤维含量约25%灰分含量约6%，水分含量约9%。蛋白可以作为微生物生长的氮源，纤维酶解后的糖及低聚度纤维素可以作为碳源，因此直接以低廉的富含蛋白、糖的万寿菊花粕提取液作为微生物发酵的原料，在降低原料成本上具有非常大的优势，同时也可以提高万寿菊花粕的价值，增加企业产品的竞争力。另外万寿菊花粕还含有叶黄素、氨基酸、维生素等各种营养成分，这些成分的存在对发酵生产虾青素起到促进作用。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用万寿菊花粕提取液为原料发酵生产虾青素的方法。
本发明的另一目的在于提供所述利用万寿菊花粕提取液为原料发酵生产虾青素的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用万寿菊花粕提取液为原料发酵生产虾青素的方法，包括如下步骤：
（1）酶解：使用纤维素酶将万寿菊花粕中纤维素酶解，得到糖和低聚度纤维素等酶解产物；
（2）万寿菊花粕提取液的提取：将水和万寿菊花粕酶解产物混合均匀，于70~90℃下浸提，得到万寿菊花粕浆，将万寿菊花粕浆离心，得到万寿花粕提取液；
（3）发酵培养基的制备：将步骤（2）得到的万寿菊花粕提取液作为培养基碳源和氮源，加入无机盐制成发酵培养基，灭菌；
（4）种子液的制备及发酵：将红发夫酵母种子液接入步骤（3）得到的灭菌发酵培养基，进行发酵；
（5）虾青素的提取：收集菌体，对菌体进行干燥、破壁、提取、浓缩，得到虾青素。
步骤（1）中所述的酶为液态纤维素酶（酶活力18000u/ml），酶浓度为7%（m/m）、料液比为1:20、萃取前保温时间为1.5h、搅拌速度为700r/min、酶解时间为3h。
步骤（2）中所述的水的体积用量（ml）优选为相当于所述万寿菊花粕质量（g）的10~20倍，水为去离子水。
步骤（2）中所述的浸提的温度优选为80℃。
步骤（2）中所述的浸提的时间优选为至少1小时，更优选为80~110min，最优选为90min。
步骤（2）中所述的离心条件优选为25℃，3000rpm离心15分钟。
步骤（3）中所述的发酵培养基的组成优选如下：400-600g/l万寿菊花粕提取液、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钙0.1g/l。
步骤（3）中所述的灭菌条件优选为115~130℃下灭菌20~40min。
步骤（4）中所述的红发夫酵母优选为红发夫酵母as2.1557菌株或atcc66270菌株。所述的atcc66270菌株优选为通过驯化后再用于发酵。所述的驯化为将所述atcc66270菌株置于含万寿菊花粕提取液成分的培养基中培养。
步骤（4）中所述的红发夫酵母的接种量为发酵培养基体积的5~10%，优选为体积百分比8~10%。
步骤（4）中所述的发酵条件为红发夫酵母常用的发酵条件，优选为在20~25℃下于摇瓶或生物反应器下培养72~360h；更优选为在22℃下发酵。所述的摇瓶培养条件优选为转速150~220rpm。所述的生物反应器的培养条件优选为溶解氧浓度控制在10~80%，优选20~50%。
步骤（4）中所述的发酵的方式为分批发酵、连续发酵和流加发酵中的一种。
步骤（5）中所述的菌体的收集可通过离心或过滤方法实现。
步骤（5）中所述的菌体的破壁可采用酸热法、高压均质或者酶法破壁。
步骤（5）中所述的提取为通过有机溶剂对破壁菌体进行提取虾青素。所述的有机溶剂优选为食品级乙醇。所述的浓缩方法优选为真空浓缩。所述利用万寿菊花粕为原料发酵生产虾青素的方法可应用于工业化生产虾青素。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）万寿菊花粕是公司提取叶黄素的副产物，具有量大、廉价等优点。
（2）发酵培养基非常简单，只有万寿菊花提取液和无机盐，磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙等。
（3）此法生产的虾青素的产量明显高于其他培养基。这可能由于万寿菊花粕还含有叶黄素等类胡萝卜素成分，这些成分的存在对发酵生产虾青素起到促进作用。
（4）通过连续补料发酵，延长红发夫酵母的对数期，大大提高红发夫酵母菌体的积累及虾青素的产量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：利用万寿菊花粕提取液摇瓶发酵生产虾青素的方法
（1）红发夫酵母种子液的制备：将一环红发夫酵母为as2.1557菌苔（于22℃培养3~4天得到的斜面种）接种于装有25ml种子培养基的250ml三角瓶，22℃、220rpm培养36h。其中种子液培养基采用ypd培养基，培养基主要成分为葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l，溶剂为去离子水。
（2）发酵培养基的制备：500g/l万寿菊花粕提取液、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钙0.1g/l，于115℃下灭菌20min。万寿菊花粕提取液的制备步骤如下：使用液态纤维素酶（酶活力18000u/ml）将万寿菊花粕中纤维素酶解，得到糖和低聚度纤维素等酶解产物，酶浓度为7%（m/m）、料液比为1:20、萃取前保温时间为1.5h、搅拌速度为700r/min、酶解时间为3h；将水和万寿菊花粕酶解产物混合均匀，水的体积用量（ml）为万寿菊花粕质量（g）的15倍，水为去离子水，于80℃下浸提，得到万寿菊花粕浆，将万寿菊花粕浆离心，得到万寿花粕提取液。
（3）利用万寿菊花粕提取液发酵生产虾青素：将步骤（1）制备好的种子液以10%（v/v）的接种量接入步骤（2）得到的发酵培养基中，好氧发酵，培养温度为22℃，摇床转速为220rpm，发酵120h后终止。通过分光光度计法测定类胡萝卜素量，测得类胡萝卜素产量为5.0mg/l；通过干重法测得酵母生物量为12.5g/l。
实施例2：利用万寿菊花粕提取液反应器恒速流加发酵生产虾青素的方法
（1）红发夫酵母种子液的制备：
①驯化：将一环红发夫酵母为atcc66270菌苔（于22℃培养3~4天得到的斜面种）接种于装有5ml种子培养基的试管中，22℃、220rpm培养36h，转接0.5ml至装有5ml种子培养基的试管中，22℃、220rpm培养36h，连续转接10次。
②种子液的制备：最后取2.5ml接种于装有25ml种子培养基的250ml三角瓶，22℃、220rpm培养36h，作为种子液。
其中种子液培养基采用万寿菊花粕培养基，培养基主要成分为500g/l万寿菊花粕提取液、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钙0.1g/l，于115℃下灭菌20min。万寿菊花粕提取液的制备同实施例1步骤（2）。
（2）发酵培养基的制备：500g/l万寿菊花粕提取液、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钙0.1g/l，溶剂为去离子水。
（3）利用万寿菊花粕提取液发酵生产虾青素的反应器培养在5l生物反应器中进行，装液量3000ml。接种量10%，培养温度为22℃，溶氧控制在30%以上，ph=5.0，发酵120h后终止。色素产量为100.65mg/l；酵母生物量为13.23g/l。
对比例1
（1）红发夫酵母种子液的制备同实施例1。
（2）发酵培养基的制备：葡萄糖20g/l、蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l，于115℃下灭菌20min。
（3）利用葡萄糖发酵生产虾青素：其他发酵条件同实施例1。培养120h后，收集菌体。色素产量为3.452mg/l，细胞干重达到5.02g/l。
对比例2
（1）红发夫酵母（atcc66270）种子液的制备同实施例2。
（2）发酵培养基的制备：葡萄糖20g/l、硫酸铵5g/l、磷酸二氢钾1g/l、氯化钠0.1g/l、硫酸镁0.5g/l、酵母粉1g/l、氯化钙0.1g/l，于115℃下灭菌20min。
（3）利用葡萄糖发酵生产虾青素：其他发酵条件同实施例2。培养120h后，收集菌体。色素产量为36.78mg/l，细胞干重达到4.02g/l。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精深实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。