技术领域：
本发明涉及医药化学领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的甘草查尔酮a二氢嘧啶类化合物及其合成方法。
背景技术：
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肿瘤已严重威胁到人类的健康，寻找有效安全、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发工作者孜孜以求的目标。随着药物化学的发展，以嘧啶环为结构母核的化合物在肿瘤治疗中的作用引起广泛关注。
甘草查尔酮a被视为胀果甘草的种属特异性成分，其结构如下所示。
近年来，研究发现甘草查尔酮a具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降脂、解痉和抗疟抗寄生虫等多种生物活性，在医药领域具有很大的开发价值。但甘草查尔酮a是平面性强的分子，水溶性差，所以，通过合理、安全的结构修饰来增强甘草查尔酮a的水溶性，开发天然产物甘草查尔酮a的更多生物活性成为亟待解决的问题。
技术实现要素：
：
本发明的一个目的是提供一类具有抗肿瘤活性的甘草查尔酮a二氢嘧啶类化合物及其合成方法。
本发明的实现过程如下：
结构通式(i)所示的化合物，
其中：r为c1-c4的烷基，c1-c4的烷氧基，取代或未取代的苯基，取代或未取代的苄基、硝基；
所述的取代为单取代或多取代，取代基为：卤素、c1-c4的烷氧基、氰基、三氟甲基、苯氧基。
结构通式(i)所示的化合物的合成方法，以甘草查尔酮a、脲类化合物为原料，以有机碱为催化剂，在甲苯作为反应溶剂的条件下进行合成：
具体来说，包括如下步骤，
(1)向反应器中按摩尔比为1:1～1:1.5加入甘草查尔酮a、脲类化合物，加入有机溶剂混合均匀，加入有机碱催化剂，80℃～120℃回流反应3～8小时；
(2)将步骤(1)反应体系的固液混合物减压浓缩后，柱层析分离提纯，干燥得到目标产物。
步骤(1)中所述的甘草查尔酮a与硫脲类化合物的摩尔比优选为1:1～1:1.3，有机溶剂为甲苯或dmf，反应温度优选为105℃～115℃，有机碱优选为三乙胺。
嘧啶环是很多天然化合物和合成药物中的核心结构单元，作为杂环化合物中的一个重要分支，嘧啶类化合物因其具有高效、低毒，以及其环上取代基可以多方位的变换而在药物领域中得到广泛应用。将嘧啶环引入甘草查尔酮a的化学结构中，有望增强其生物活性，提高选择性，具有重要的理论价值和实际应用价值。
本发明的优点在于：原料环保，生产成本低，操作安全性高，反应条件温和，可实现反应原料的充分利用，适用于工业化生产，解决了现有技术产率低的问题，同时将嘧啶环引入到甘草查尔酮a的化学结构中，对探究该类化合物的生物活性与总结构效关系具有重要的理论价值和应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。
一类具抗肿瘤活性的甘草查尔酮a二氢嘧啶类化合物的合成方法包括如下步骤：
(1)向反应器中按摩尔比为1:1～1:1.5加入甘草查尔酮a、脲类化合物，加入甲苯或dmf混合均匀，其中溶剂体积小于反应器容积的2/3，加入有机碱催化剂三乙胺，置于磁力搅拌器上搅拌，加热到80℃～120℃，回流反应3～8小时；
(2)反应过程中使用薄层色谱追踪，及时监测反应的进行程度，待原料反应完全后停止加热，撤去冷凝装置；
(3)将步骤(2)反应体系的固液混合物减压浓缩后，柱层析分离提纯，干燥得到目标产物。
本发明部分优选实施方案中的化合物结构式如下所示：
实施例1
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-1-甲基-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(1)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和56.92mg1-甲基脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应3小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末113.41mg，总收率48.65％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：8.04(2h,d),7.03(1h,s),6.83(2h,d),6.48(1h,s),6.31(1h,m),5.31(2h,s),5.06-4.95(2h,m),5.03(1h,t),3.81(3h,s),3.51(3h,s),1.97-1.61(2h,m),1.56(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.3,161.3,156.6,155.4,154.2,147.7,133.4,129.2,125.7,116.2,110.6,101.5,56.6,53.2,40.6,39.2,35.6,28.3；ms(esi)for(m+h)+:395.2.
实施例2
1-苄基-6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(2)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和115.39mg1-苄基脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应5小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末121.79mg，总收率43.79％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):7.89(2h,d),7.25-7.20(5h,m),6.98(1h,s),6.90(2h,d),6.47(1h,s),6.31(1h,m),5.41(2h,s),5.03-4.97(2h,m),4.94(1h,s),4.26(2h,s),3.87(3h,s),1.87-1.62(2h,m),1.53(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.6,161.8,156.5,155.3,154.0,147.4,136.6,133.5,129.2,128.6,127.6,125.4,116.2,110.6,101.8,56.6,51.5,50.4,41.2,39.5,28.3；ms(esi)for(m+h)+:471.2.
实施例3
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-1-苯基-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(3)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和104.61mg1-苯基脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末130.64mg，总收率48.42％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.94-7.85(4h,m),7.43(3h,t),6.93(1h,t),6.85(2h,d),6.47(1h,s),6.33(1h,m),5.37(2h,s),5.03-4.98(2h,m),4.94(1h,s),3.87(3h,s),1.95-1.63(2h,m),1.59(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.6,161.3,154.9,147.3,139.5,133.2,129.0,128.1,127.5,125.8,121.6,116.0,110.1,102.8,61.3,56.6,40.4,39.8,28.3；ms(esi)for(m+h)+:457.2.
实施例4
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-1-(邻甲苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(4)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和115.39mg1-(邻甲苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应8小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末136.41mg，总收率49.05％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.89(2h,d),7.86(2h,t),7.25(1h,t),7.08(1h,t),6.95(1h,s),6.90(2h,d),6.47(1h,s),6.32(1h,m),5.39(2h,s),5.03-4.98(2h,m),4.94(1h,s),3.82(3h,s),2.17(3h,s),1.96-1.68(2h,m),1.50(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):164.7,161.3,155.4,154.8,147.7,136.6,134.3,133.5,130.7,129.2,125.5,121.6,118.4,116.3,110.9,101.8,61.9,56.4,40.1,28.6,17.5；ms(esi)for(m+h)+:471.2.
实施例5
1-(2-氟苯基)-6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(5)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和118.43mg1-(2-氟苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到120℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末140.11mg，总收率49.96％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):7.25(5h,m),7.01(1h,t),6.98(2h,d),6.87(2h,d),6.41(1h,s),5.35(2h,s),5.00-4.98(2h,d),4.9(1h,t),3.83(3h,s),1.91-1.66(2h,m),1.69(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.2,162.8,160.8,154.9,153.7,148.8,133.2,129.1,128.0,125.2,125.2,123.6,121.6,115.9,110.3,101.8,61.7,56.4,40.8,39.4,28.4；ms(esi)for(m+h)+:475.2.
实施例6
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-1-(2-甲氧基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(6)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和127.68mg1-(2-甲氧基苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到105℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末(141.72mg)，总收率49.28％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):7.84(2h,d),7.61(1h,d),7.11(2h,d),6.97(1h,t),6.86(1h,s),6.81(2h,d),6.46(1h,s),6.32(1h,m),5.40(2h,s),5.00-4.97(2h,m),4.92(1h,t),3.84(6h,s),1.97-1.68(2h,m),1.58(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):164.7,161.3,160.6,154.9,153.4,147.8,133.2,129.5,128.2,126.0,125.2,121.4,118.3116.4,112.8,110.3,103.8,61.6,55.9,40.4,39.8,28.3；ms(esi)for(m+h)+:487.2.
实施例7
1-(2-溴苯基)-6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(7)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和165.23mg1-(2-溴苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到115℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末142.35mg，总收率44.98％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.86(2h,d),7.81(1h,d),7.65(1h,d),7.36(1h,t),7.11(1h,t),6.85(1h,s),6.78(2h,d),6.44(1h,s),6.30(1h,m),5.35(2h,s),5.04-4.98(2h,m),4.93(1h,m),3.89(3h,s),1.91-1.66(2h,m),1.57(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):164.6,161.5,154.9,153.7,148.8,140.9,133.2,131.8,129.5,128.3,125.2,122.6,121.6,116.0,110.9,103.8,60.6,56.5,40.9,39.9,28.2；ms(esi)for(m+h)+:535.1.
实施例8
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-1-(间甲苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(8)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和115.39mg1-(间甲苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末147.88mg，总收率53.17％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):7.86(2h,d),7.76(1h,s),7.64(1h,d),7.31(1h,t),6.97(2h,m),6.84(2h,d),6.47(1h,s),6.32(1h,m),5.36(2h,s),5.08-4.98(2h,m),4.93(1h,t),3.82(3h,s),2.34(3h,s),1.96-1.62(2h,m),1.57(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.1,161.1,154.9,153.7,147.8,138.9,133.2,129.1,128.3,125.4,124.6,121.6,121.3,116.3,110.6,103.8,61.6,56.6,40.2,28.6,21.3；ms(esi)for(m+h)+:471.2.
实施例9
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-1-(3-羟基苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(9)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和116.90mg1-(3-羟基苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到80℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末147.31mg，总收率52.75％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.87(2h,d),7.35(2h,m),7.27(1h,t),6.96(1h,s),6.82(2h,d),6.71(1h,d),6.45(1h,s),6.32(1h,m),5.37(3h,s),5.04-4.98(2h,m),4.92(1h,t),3.85(3h,s),1.98(1h,m),1.57(6h,s),1.68(1h,m)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.1,161.4,158.7,154.9,153.7,147.8,141.6,133.2,130.3,129.1,128.3,125.2,121.6,120.3,116.3,114.6,110.9,106.3,101.8,61.5,56.6,40.2,28.2；ms(esi)for(m+h)+:473.2.
实施例10
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-1-(3-(三氟甲基)苯基)-5，6-二氢嘧啶-2(1h)-酮10)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和156.85mg1-(3-(三氟甲基)苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末131.67mg，总收率42.47％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：8.34(1h,s),7.87(3h,d),7.38(2h,d),6.94(1h,s),6.83(2h,d),6.46(1h,s),6.32(1h,m),5.40(2h,s),5.05-4.95(2h,m),4.94(1h,t),3.85(3h,s),1.95-1.63(2h,m),1.54(6h,s)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.1,161.4,154.9,153.7,147.8,139.4,133.2,130.9,129.1,128.3,125.2,124.1,121.6,120.7,116.3,114.6,110.9,102.8,61.3,56.6,39.9,28.2；ms(esi)for(m+h)+:525.2.
实施例11
1-(4-氟苯基)-6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(11)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和118.43mg1-(4-氟苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末129.11mg，总收率46.04％。
褐色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6):7.88(2h,d),7.74(2h,d),7.22(2h,t),6.95(1h,s),6.86(2h,d),6.46(1h,s),6.32(1h,m),5.37(2h,s),5.02-4.98(2h,m),4.92(1h,t),3.85(3h,s),1.93(1h,m),1.57(6h,s),1.68(1h,m)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):165.1,162.5,161.6,154.9,153.7,148.8,134.7,133.2,129.4,125.2,123.2,121.6,115.9,110.7,103.8,61.4,56.4,40.2,28.2；ms(esi)for(m+h)+:475.2.
实施例12
1-(4-氯苯基)-6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(12)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和131.07mg1-(4-氯苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末140.22mg，总收率48.32％。
棕色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.83(2h,d),7.82(2h,d),7.47(2h,d),6.85(2h,d),6.41(1h,s),6.30(1h,m),5.34(3h,s),5.02-4.98(2h,m),4.92(1h,t),3.81(3h,s),1.95(1h,m),1.73(6h,s),1.57(1h,m)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):164.2,161.3,154.9,153.7,147.8,134.2,133.2,128.9,125.4,121.6,116.0,110.8,103.8,61.3,56.1,40.2,28.0；ms(esi)for(m+h)+:491.2.
实施例13
1-(4-氨基苯基)-6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(13)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和116.15mg1-(4-氨基苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末139.67mg，总收率50.12％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.85(2h,d),7.05(2h,d),6.95(1h,s),6.85(2h,d),6.61(2h,d),6.41(1h,s),6.30(1h,m),6.27(2h,s),5.35(2h,s),5.00-4.98(2h,m),4.9(1h,t),3.83(3h,s),1.94(1h,m),1.63(6h,s),1.69(1h,m)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):164.2,161.3,154.9,153.7,149.0,144.2,133.4,132.2,129.0,127.7,125.4,121.8,116.4,110.9,104.0,61.3,56.6,40.2,28.3；ms(esi)for(m+h)+:472.2.
实施例14
6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-1-(4-甲氧基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(14)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和127.68mg1-(4-甲氧基苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末136.83mg，总收率47.58％。
棕黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.96(1h,d),7.82(2h,d),6.92(3h,m),6.86(2h,d),6.46(1h,s),6.31(1h,t),5.38(2h,s),5.03-4.98(2h,m),4.92(1h,t),3.85(3h,s),1.93(1h,m),1.63(6h,s),1.59(1h,m)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δppm):164.2,161.3,159.0,154.9,153.8,148.9,133.2,131.6,129.2,128.5,125.4,122.8,121.9,116.2,114.7,111.0,103.9,61.3,55.9,40.2,28.3；ms(esi)for(m+h)+:487.2.
实施例15
1-(2,4-二甲基苯基)-6-(4-羟基-2-甲氧基-5-(2-甲基丁-3-烯-2-基)苯基)-4-(4-羟基苯基)-5,6-二氢嘧啶-2(1h)-酮(15)的制备。
在反应器中加入200mg甘草查尔酮a和126.16mg1-(2,4-二甲基苯基)脲，加50ml甲苯和5mldmf作反应溶剂，加入0.5ml三乙胺作为催化剂，电热套加热到100℃，磁力搅拌回流反应6小时。薄层色谱追踪反应，反应结束后，减压浓缩，柱层析，脱干得到棕色粉末(142.12mg)，总收率49.62％。
黄色结晶性粉末固体。1hnmr(400mhz,dmso-d6)：7.89(2h,d),7.61(2h,d),7.08(1h,s),7.01(1h,d),6.82(2h,d),6.46(1h,s),6.30(1h,m),5.35(2h,s),5.03-4.98(2h,m),4.9(1h,t),3.83(3h,s),2.34(3h,s),2.29(3h,s),1.91(1h,m),1.69(6h,s),1.66(1h,m)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):164.2,161.0,154.9,153.5,148.9,143.6,134.2,133.2,131.3,129.3,128.3,126.4,125.1,121.7,116.1,111.0,104.0,61.6,55.9，40.2,28.3,21.9,17.3；ms(esi)for(m+h)+:485.2.
实施例16本发明化合物的抗肿瘤活性测试
对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验,试验方法采用常规的mtt法。
细胞株选用：人前列腺癌(pc-3)，人胃腺癌细胞(sgc-7901)，人肺癌细胞(a-549)。培养液为dmem+15％nbs+双抗。
样品液的配制：用dmso(merck)溶解后，加入pbs(-)配成的100μmol/l的溶液或者均匀的混悬液，然后用dmso的pbs(-)稀释，最终浓度分别为0.1,1,10,20,40,60,80,100μmol/l。
将抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶(5-fu)以同样的条件配成对照品溶液。
细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞细胞培养于含10％灭活新生牛血清和青霉素、链霉素(各100万u/l)的1640培养液中，置于37℃，5％co2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3天传代1次，传代时首先倒出培养液，pbs洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。
mtt法检测细胞活性及ic50的测定：
实验原理：活细胞线粒体中脱氢酶能将黄色的mtt还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜(mttformazan),并沉积在细胞中，生成的量与活细胞数目成正比，而死细胞没有这种功能。dmso能溶解蓝紫色结晶物，颜色深浅与所含的量成正比，因此用酶标仪测定的光吸收值可反映细胞存活率。
实验方法：取对数生长期细胞，消化、计数，以3×105/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔100μl。培养24小时后，将待测化合物以0.1,1,10,20,40,60,80,100μmol/l浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4％dmso的培养液作对照。药物作用48小时后，去上清，每孔加入100μlmtt(2-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-3,5-二苯基-2h-四唑氢溴酸盐)(1mg/ml)，继续培养4小时，弃上清，每孔加入100μldmso，振荡混匀，用酶标仪在570nm处测定吸光度值，采用ic50计算软件求出半数抑制浓度(ic50)。
试验结果详见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的甘草查尔酮a二氢嘧啶类衍生物，样品编号对应制备实施例中所得到的化合物的具体编号。
表1化合物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度ic50(单位：μmol/l)
表1结果显示，化合物1-15在所测试的3种细胞株中均表现出了不同程度的抗肿瘤活性,其中化合物11、12和5的活性较好，对细胞呈现较强的抑制效果，在特定细胞株中抗肿瘤活性优于或等同于5-氟尿嘧啶，对不同肿瘤细胞株具有明显选择性。综上，本发明的甘草查尔酮a二氢嘧啶类衍生物可作为抗肿瘤候选药物进一步进行临床前研究，也可以做为抗肿瘤先导化合物进一步研究。